🔧 Lösung: Bereits alignierte modBAM-Dateien mit nf-core/methylong v2.0.0

📊 Analyse Ihrer BAM-Datei

✅ Gute Nachrichten: Ihre Datei An6_6mA_mapped.mod.bam ist:

• Bereits aligniert (@SQ Header mit Chromosomen/Positionen vorhanden)
• Enthält 6mA-Modifikationen (MM:Z:A+a… und ML:B:C Tags sichtbar)
• Von Dorado basecalled (PN:dorado VN:2.0.0+…)

❌ Problem: Die Pipeline versucht trotzdem, den Dorado-Aligner erneut auszuführen → Docker-Auth-Fehler.

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🚨 Shell-Fehler beheben: Befehl korrekt eingeben

Die Fehler --ont_aligner: command not found entstehen, weil Multi-Line-Befehle mit \ nicht korrekt verarbeitet werden.

Option A: Als einzeiliger Befehl (empfohlen):

nextflow run nf-core/methylong -r 2.0.0 -profile docker --input samplesheet_6mA.csv --outdir methylome_out_6mA --ont_aligner minimap2 --m6a -resume -work-dir methylome_out_6mA/work

Option B: Multi-Line mit korrekter Syntax (kein Leerzeichen nach \!):

nextflow run nf-core/methylong \
  -r 2.0.0 \
  -profile docker \
  --input samplesheet_6mA.csv \
  --outdir methylome_out_6mA \
  --ont_aligner minimap2 \
  --m6a \
  -resume \
  -work-dir methylome_out_6mA/work

Option C: In ein Skript schreiben (run_methylong.sh):

#!/bin/bash
nextflow run nf-core/methylong \
  -r 2.0.0 \
  -profile docker \
  --input samplesheet_6mA.csv \
  --outdir methylome_out_6mA \
  --ont_aligner minimap2 \
  --m6a \
  -resume \
  -work-dir methylome_out_6mA/work

chmod +x run_methylong.sh && ./run_methylong.sh

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⚙️ Samplesheet für bereits alignierte modBAM-Dateien

Da Ihre BAM-Datei bereits aligniert ist, gibt es zwei Ansätze:

🔹 Ansatz 1: --reset verwenden (Pipeline aligniert neu)

group,sample,path,ref,method
group1,An6,/mnt/md1/DATA/Data_Tam_DNAseq_2026_An6_BG5/An6_6mA_mapped.mod.bam,/mnt/md1/DATA/Data_Tam_DNAseq_2026_An6_BG5/bacass_out/Medaka/An6-unicycler-medaka_polished_genome.fa,ont

# Befehl mit --reset (entfernt alte Alignment-Info, aligniert mit minimap2 neu)
nextflow run nf-core/methylong -r 2.0.0 -profile docker --input samplesheet_6mA.csv --outdir methylome_out_6mA --ont_aligner minimap2 --reset --m6a -resume

🔹 Ansatz 2: Pipeline “austricksen” – unalignierte BAM simulieren

Wenn Sie das bestehende Alignment behalten möchten:

1. BAM ohne Alignment-Info exportieren (behält MM/ML-Tags):

   samtools collate -Ou An6_6mA_mapped.mod.bam | \
   samtools fastq -T MM,ML - > An6_6mA_with_mods.fastq

2. Samplesheet mit FASTQ-Pfad (Pipeline basecallt nicht, da keine Pod5/FAST5):

   group,sample,path,ref,method
   group1,An6,/pfad/zu/An6_6mA_with_mods.fastq,/pfad/zu/genome.fa,ont

3. Pipeline mit --skip_basecalling-Ersatz starten:

   ⚠️ Da --skip_basecalling nicht existiert: Die Pipeline erkennt FASTQ ohne Basecalling-Info und springt direkt zu Alignment. Kombinieren Sie mit --ont_aligner minimap2:

   nextflow run nf-core/methylong -r 2.0.0 -profile docker --input samplesheet_6mA.csv --outdir methylome_out_6mA --ont_aligner minimap2 --m6a -resume

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🧪 Schnelltest: Läuft die Pipeline mit minimap2?

# 1. Work-Directory aufräumen (falls vorheriger Run fehlschlug)
rm -rf methylome_out_6mA/work/a1/

# 2. Minimaler Testlauf (nur bis Alignment)
nextflow run nf-core/methylong \
  -r 2.0.0 \
  -profile docker \
  --input samplesheet_6mA.csv \
  --outdir methylome_out_6mA_test \
  --ont_aligner minimap2 \
  --m6a \
  -resume \
  -work-dir methylome_out_6mA_test/work \
  -entry align 2>&1 | tee test_align.log

💡 Der -entry align Parameter startet die Pipeline nur bis zum Alignment-Schritt (falls in v2.0.0 verfügbar – sonst weglassen).

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📋 Checkliste vor dem Start

Prüfpunkt	Befehl/Ziel
✅ Samplesheet-Spalten	group,sample,path,ref,method (exakt!)
✅ Absolute Pfade	Keine relativen Pfade wie ./file.bam
✅ BAM-Datei lesbar	samtools quickcheck An6_6mA_mapped.mod.bam && echo "OK"
✅ MM/ML-Tags vorhanden	samtools view file.bam \| head -1 \| grep -q "MM:Z" && echo "Mods OK"
✅ Docker läuft	docker run hello-world
✅ Ausreichend RAM/CPU	Min. 16 GB RAM, 8 CPUs empfohlen

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🔄 Alternative: Manueller modkit-Pileup (ohne Nextflow)

Falls die Pipeline weiterhin Probleme macht, können Sie modkit direkt auf Ihrer BAM-Datei anwenden:

# 1. Referenz indexieren
samtools faidx /pfad/zu/genome.fa

# 2. modkit pileup für 6mA
modkit pileup sample \
  An6_6mA_mapped.mod.bam \
  methylome_out_6mA/An6_6mA.pileup.bed \
  --ref /pfad/zu/genome.fa \
  --modify-motif 6mA \
  --cpg \
  -t 8

# 3. Zu BigWig konvertieren (für IGV)
bedGraphToBigWig methylome_out_6mA/An6_6mA.pileup.bed genome.fa.sizes methylome_out_6mA/An6_6mA.bw

📦 modkit installieren: pip install modkit oder via Docker: docker pull nanoporetech/modkit

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🎯 Empfohlener nächster Schritt

# 1. Samplesheet prüfen
cat samplesheet_6mA.csv

# 2. Einzeiligen Nextflow-Befehl ausführen (mit minimap2):
nextflow run nf-core/methylong -r 2.0.0 -profile docker --input samplesheet_6mA.csv --outdir methylome_out_6mA --ont_aligner minimap2 --m6a -resume -work-dir methylome_out_6mA/work

Bei weiteren Fehlern: Bitte den Inhalt von .nextflow.log teilen – dann kann ich gezielt helfen! 🚀