两个基因的 locus_tag 分别是：

• 毒素（toxin）：HJI06_09100，坐标 complement(1889026..1889421)
• 抗毒素（antitoxin）：HJI06_09105，坐标 complement(1889421..1889651)

这里有一个非常重要的更正：它们在 complement，也就是 负链（minus strand）。 因此“操纵子上游/启动子在前端”对应的方向是：

• 负链基因的“上游（5’端）”在 更大的坐标数那一侧
• 你的 TA 单元从坐标上看是 1889651（更大）→ 1889026（更小） 这个方向转录

你想把 toxin+antitoxin 当一个单元一起 knockdown，那么最有效的策略通常是： 优先打在 antitoxin 的 5’端附近（靠近 1889651 一侧）以及其上游启动子区域，这样最容易把整条共转录本压下去。

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1) “paired guides（成对 guides）”用中文再讲清楚

paired guides = 为同一个目标（同一个基因/同一转录单元）挑两条不同位置的 guide，同时表达，让 dCas9 在两个点上“堵住”转录，从而增强抑制的强度或稳定性。

• 它不是“分别打两个基因”这个意思

• 对你来说更合适的用法是：

  • 1 条 guide 卡在 启动子/TSS 附近
  • 另 1 条卡在 操纵子前段（这里就是 antitoxin 5’端或紧邻区域）
• GuideFinder 会按你设置的“最小间距”（常见 100 bp）去输出可用的 guide 对

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2) 用 GuideFinder 给 HD46（CP052959.1）这两个 locus_tag 设计 guides：实操步骤

下面按“你有完整基因组（complete genome）”的最常见流程写（你不需要自己手算 NGG 位点，GuideFinder 会做）。

Step A：准备文件

从 NCBI 下载这两个文件到同一目录（建议）：

1. 基因组序列 FASTA：CP052959.1.fna
2. 基因组注释 GenBank：CP052959.1.gbff（或 .gbk）

FASTA 提供序列；GenBank 提供 gene/CDS 坐标和 locus_tag。GuideFinder 依赖这些信息来定位目标基因并取启动子区域。

Step B：安装依赖

你需要：

• R / RStudio
• BLAST+（命令行 blastn）：GuideFinder 用它做 off-target（脱靶）筛查
• 下载 GuideFinder（GitHub: ohlab/Guide-Finder）的 Rmarkdown/R 脚本

Step C：准备目标基因列表

建一个文本文件（例如 targets.txt），内容就两行：

HJI06_09100
HJI06_09105

Step D：在 GuideFinder 里设置关键参数（推荐给 S. epidermidis 的组合）

因为 S. epidermidis GC 偏低，建议用“先严格、再迭代放宽”的策略（GuideFinder 的特色功能）：

第一轮（主参数）

• PAM：NGG（默认 SpCas9）
• GC minimum：35%（或稍低一点）
• TSS/启动子附近优先：让它偏向“离 TSS 更近”的 guide
• off-target：开启（强烈建议不要关）

迭代轮（只针对第一轮找不到 guide 的基因自动放宽）

• GC minimum：降到 30%
• TSS 最大距离：放宽
• 必要时再放宽一些序列过滤（同聚物等），但 off-target 最好别放得太松

Step E：运行并看输出

GuideFinder 通常会给你两类输出表（名字可能因版本略有不同）：

1. Top hits（单条 guide 推荐）
2. Paired guides（成对 guide 推荐）

你现在的目标是“把 TA 单元一起压下去”，所以你从输出里优先挑：

• 靠近 1889651 一侧（负链的 5’端/上游）的 guides

  • 重点看 HJI06_09105（antitoxin）输出里最靠前、最接近其 5’端/推定启动子区的 guides
  • HJI06_09100（toxin）也会出 guides，但从“整单元 knockdown”角度，最“入口”的位置通常更强

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3) 针对你这个 TA 单元，怎么挑“最可能一把压住两基因”的 guide

因为它们紧挨着且共转录，你最推荐的组合是：

方案 1：单 guide（最简、最常成功）

• 选 1 条 最接近操纵子启动子/TSS 的 guide
• 实验上先用它验证 toxin 与 antitoxin 的 mRNA 是否都下降（RT-qPCR 两个都测）

方案 2：paired guides（更稳的增强版）

• 选两条都位于“操纵子前端”的 guide（一般以 antitoxin 5’端/上游区域为核心）
• 两条之间满足你设的最小间距（比如 100 bp）
• 用同一个载体同时表达两条 guide（或串联表达）

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4) 一个很关键的小提醒：负链时，“上游”在坐标更大端

你最初邮件里写的是 “(+)”，但 GenBank 注释清楚写了 complement。 所以当你在 GuideFinder 输出里看到坐标时，记住：

• 越接近 1889651（更大坐标）越接近“转录起点/上游入口”
• 这类 guide 通常更容易把整个 TA 转录单元一起压下去

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把运行 GuideFinder 后输出表里与这两个 locus_tag 对应的前几条候选（包含坐标、链方向、序列、是否 off-target）贴出来，可以快速做二次筛选： 哪一条最适合做“单 guide 一把压住”，哪一对最适合做“paired guides 增强版”。