摘要
对于单纯疱疹病毒1型（HSV-1）而言，皮肤是其初始感染的主要部位。在初次裂解性感染后，病毒进入外周神经系统并建立潜伏感染状态。从潜伏感染的神经元中自发再激活，会导致典型的HSV-1相关疾病，如唇疱疹。由于皮肤中包含多种不同类型的细胞和结构，以及人类特异性的感染反应，因此建立HSV-1诱导的皮肤病理模型具有挑战性。尽管如此，使用单层细胞系、类表皮培养物、离体皮肤和小鼠模型的研究，已经极大地推动了我们对HSV-1皮肤感染机制的理解。
然而，许多皮肤特异性结构，特别是毛囊，在初始感染和病毒再激活中的作用仍不明确。本研究中，我们使用由诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的人类复杂长毛皮肤类器官作为HSV-1感染的模型。我们应用显微成像、总体和空间转录组学（具有单细胞分辨率）来深入研究特定细胞类型中的病毒生命周期及宿主反应。
我们发现病毒感染主要限于表皮中的角质形成细胞和毛囊中的特定细胞类型。此外，我们观察到细胞类型特异性的干扰素刺激基因和TNF通路的激活。我们还追踪了组织内的旁分泌信号传导，发现TNF反应基因在邻近细胞中被上调。
综上所述，皮肤类器官与新型空间转录组技术的结合，为HSV-1在皮肤中的感染提供了一个生理上高度相关的模型系统。
引言
单纯疱疹病毒1型（Herpes Simplex Virus 1，HSV-1）是一种高度流行的人类病原体，在50岁以下人群中的全球感染率约为67%¹。原发感染通常通过黏膜表面或皮肤微小损伤发生。HSV-1最初在皮肤和黏膜的上皮细胞中进行有效复制，导致炎症和组织损伤，最终形成水疱²。在上皮细胞复制之后，HSV-1进入外周神经元的神经末梢，并沿轴突向上传输至三叉神经节中的神经细胞体，在那里建立潜伏感染状态³⁻⁴。病毒可在没有明显诱因的情况下自发再激活，重新进入裂解性感染周期，产生具有感染性的病毒颗粒，通过轴突以前向运输的方式再次进入皮肤和黏膜的上皮细胞。随后在上皮中的裂解性感染过程导致典型的疱疹病变，并释放病毒到外界环境中²。
过去，研究人员采用了多种模型系统来阐明HSV-1在皮肤中的原发感染及再激活机制。由于皮肤结构的复杂性以及多种不同细胞类型的参与，传统的单层细胞培养体外模型只能模拟病毒生命周期的某些方面。为了更复杂地研究病毒的易感性、传播方式和细胞病变效应，研究者采用了动物模型⁵⁻⁸、离体小鼠皮肤⁸⁻¹⁰、人体皮肤切片⁸,¹¹,¹²以及类表皮培养系统¹³⁻¹⁴等模型。
尽管这些模型大大加深了我们对HSV-1在皮肤中致病机制的理解，但仍有许多方面尚不明确。尤其是毛囊等特定皮肤结构的易感性、不同成纤维细胞亚群的作用，以及某些低丰度细胞类型在原发感染、潜伏建立和病毒再激活过程中的贡献，仍未被完全阐明。类器官研究领域正在不断发展，为病毒研究提供了潜在的新模型系统¹⁵⁻¹⁷。
本研究中，我们使用了一种由人诱导性多能干细胞（hiPSCs）构建的高度复杂的人类皮肤类器官（SkO）模型，用于分析HSV-1在皮肤中的致病机制。SkO模型按照Lee及其同事的协议生成¹⁸⁻¹⁹，包含分层的表皮、富含脂肪的真皮、具有色素的产毛毛囊、皮脂腺、黑色素细胞和Merkel细胞。毛囊由施旺细胞包裹的感觉神经纤维所支配，神经元细胞体与卫星胶质细胞聚集，形成类似三叉神经节的结构。SkO模型中包含与人类胎儿第二孕期皮肤中相对应的所有细胞类型，唯独缺乏汗腺、血管化结构和免疫细胞¹⁸⁻¹⁹。与许多其他类器官类似，SkO呈现“内外翻”形态：真皮位于外侧并暴露于培养液中，而表皮位于内侧，毛囊中的毛发向类器官内部生长。
在本研究中，我们从SkO的真皮侧接种HSV-1，病毒首先感染真皮成纤维细胞，随后感染角质形成细胞，从而模拟了深层皮肤伤口或病毒再激活所引起的初始感染过程。通过显微成像、总体转录组和空间转录组（具有单细胞分辨率）技术，我们揭示了HSV-1在组织中的传播路径，并分析了空间和时间维度上的宿主免疫应答。
结果
3.1 皮肤类器官的构建
我们根据 Lee 等人提出的协议构建了皮肤类器官（Skin Organoids, SkOs）¹⁹，并通过明场显微镜观察、免疫组织化学（IHC）以及整体免疫荧光染色（WMS）对其分化情况进行了验证（见图 1 和补充图 1）。结果显示，SkOs 具有预期的头尾结构，其中头部含有真皮和表皮，尾部则含有软骨组织。我们的 SkOs 在培养约 120 天后达到了完整的复杂性。
毛囊展示出预期的结构，例如真皮乳头、基质、内根鞘和外根鞘（见补充图 1）。我们还检测到了 Merkel 细胞，以及毛囊的神经支配情况，并观察到神经元胞体在类器官尾部的聚集（见图 1）。
3.2 SkOs 感染 HSV-1
完全分化的 SkOs（约 120 天龄）被感染了携带 GFP 基因且受 CMV 早期启动子控制表达的 HSV-1 17 型株。为了观察病毒在组织内的传播，我们仅用 800 PFU 感染了一个 SkO，假设类器官表面约有 4×10³ 个细胞，这对应大约 0.2 的 MOI。感染后 2 天（2 dpi），通过荧光显微镜可以在类器官表面看到 GFP 表达的斑点（图 2A）。到 4 dpi，GFP 荧光增强并扩散至整个类器官。通过 SkO 切片免疫组化（IHC）和整体免疫荧光染色（WMS）观察到，感染最初出现在毛囊从类器官表面突出的部位（图 2B 和补充图 2）。2 dpi 时，真皮中首层成纤维细胞显示 GFP、HSV-1 早期蛋白 ICP0 和晚期蛋白 gD 的表达。4 dpi 时，感染扩展至类器官内部结构，包括表皮，其中基底层和棘层角质形成细胞均检测到 GFP、ICP0 和 gD 的阳性染色。角质层角质形成细胞未见感染迹象。同样，毛囊的各细胞层（除角化的毛发结构外）均为 GFP、ICP0 和 gD 阳性。直到 8 dpi，这些结构以及类器官尾部的软骨仍未见感染迹象。此外，我们观察到感染细胞出现明显的细胞病变效应。真皮中感染的成纤维细胞在 2 dpi 即出现首批病变迹象，4 dpi 时尤为明显。表皮中感染的角质形成细胞和毛囊内的内层细胞在 6 dpi 开始出现细胞病变，导致基底膜和毛囊结构的破坏。
MOI 是“Multiplicity of Infection”的缩写，中文通常称为“感染复数”或“感染乘数”。
它表示每个目标细胞平均接收到的病毒颗粒数量。比如：
- MOI = 1 表示平均每个细胞接收到1个病毒颗粒。
- MOI = 0.2 表示平均每5个细胞中只有1个细胞会被病毒感染。
3.3 HSV-1 感染皮肤类器官的整体转录组分析（Bulk transcriptomics）
在确认 HSV-1 能够有效感染 SkOs（皮肤类器官）后，我们进行了未处理组与 HSV-1 感染组 SkOs（在感染后第 2、4、6 和 8 天）的整体 RNA 测序（bulk RNA-seq），以分析宿主对病毒感染的反应。
在感染第 2 天（2 dpi），我们仅检测到 20 个差异表达基因（DEGs），到了第 4 天增加到约 1000 个，第 6 天和第 8 天则达到了约 5000 个（图 3A）。
由于第 2 天的差异基因数量过少，对照组与 2 dpi 组之间的 GO 富集分析未发现显著条目。第 4 天与对照组相比，在上调基因中出现了与免疫反应（如白细胞活化）和炎症（如对肿瘤坏死因子的反应）相关的 GO 术语富集（图 3B）。到了第 6 和第 8 天，下调基因中则显现出细胞分化（如皮肤发育）等相关条目富集，这可能反映了 HSV-1 典型的对宿主细胞转录的抑制效应（host cell shutoff）[^33]。
值得注意的是，在第 4 天时，病毒相关的 RNA 已占全部测序读取的约 20%，并在第 6 和第 8 天略微上升至约 25%（图 3C）。
3.4 HSV-1 感染皮肤类器官的空间转录组分析
为了全面理解 HSV-1 感染在 SkO（皮肤类器官）模型中的时间和空间动态以及宿主反应，我们采用了空间转录组技术。我们在 Xenium 平台上进行了两次具有单细胞分辨率的空间转录组实验。首次试验中分析了未感染的 SkO 以及感染后第 2 天和第 6 天的切片；在主实验中则改为分析第 2、3 和 4 天的样本（见图 4）。
我们检测了约 500 个基因的表达，包括五个病毒转录本（HSV-1 的 US1、UL27、UL29、UL54 和 LAT）。通过非整合式的转录组数据，我们为细胞分配了类型身份（图 4A 和补图 3A-D）。我们识别出了所有预期的细胞类型，包括如 Merkel 细胞这类丰度较低的类型，这与 Lee 等人使用单细胞测序和免疫染色获得的结果一致。
此外，基于转录组的细胞类型分配还能区分具有特定空间定位的亚型，例如表皮附近或远离表皮定位的不同成纤维细胞（乳头状和间充质型）。表皮的不同角质形成细胞亚型（基底层、棘层、颗粒层和角质层）也能被区分，且具有明确的空间定位。毛囊细胞类型（真皮鞘、外根鞘、内根鞘、基质、膨大区）也得以识别，且符合其预期的空间分布。
在感染的 SkO 中细胞类型识别也同样成功（图 4B）。但在某些感染严重的细胞中，特别是成纤维细胞，其转录特征丢失，无法归类，被标记为“未定义”（图 4B 上部中间区域的灰色细胞，以及补图 3C）。例如，我们观察到在高度感染的细胞中，成纤维细胞标志物 PDGFRα 的 mRNA 表达完全丧失，这表明宿主细胞转录被病毒关停（图 4C 与 4D 上面两图比较）[^33]。
随着感染程度加重（4 dpi），未定义细胞比例升高，但总体未超过总细胞数的约 15%（图 4E）。
我们接着分析了 HSV-1 的五个转录本（US1/ICP22、UL54/ICP27、UL29/ICP8、UL27/gB 和 LAT）在 SkO 中的表达，发现感染起始于真皮外层的成纤维细胞（2 dpi），并逐步蔓延至类器官内部，最终于 4 dpi 达到表皮（图 4D 和补图 3B），这一发现也与蛋白染色的结果一致。
为研究 SkO 中不同细胞类型对 HSV-1 的易感性和病毒基因表达差异，我们比较了皮肤的主要细胞类型（成纤维细胞和角质形成细胞）中感染细胞的比例。我们聚焦于数量最多的成纤维细胞亚型（乳头型1和2）以及角质形成细胞中的基底层和棘层亚型。
在统计每种细胞中至少含有 2 个病毒转录本的比例时，发现乳头型1成纤维细胞在早期感染时被感染的比例更高，这可能是因为其位于类器官外侧，更易暴露于病毒（图 4F 上图）。到了第 4 天，乳头型1和2成纤维细胞的感染比例相近，而角质形成细胞仍然具有较低的感染比例。此外，角质形成细胞中的病毒载量始终显著低于成纤维细胞（图 4F 下图）。
由于我们仅检测了五个病毒转录本，无法评估病毒完整的基因表达周期。因此，我们专注分析早期基因 UL54 和晚期 LAT 的表达。当我们按病毒载量对细胞进行排序时，在乳头型成纤维细胞中观察到了预期的模式：UL54 在初期迅速上升，随后趋于平台或下降，而 LAT 表达则持续增加（图 4G）。但在基底层角质形成细胞中，病毒复制速度明显较慢，且存在滞后期的迹象。
值得注意的是，基底层角质形成细胞位于组织较深处，而乳头型成纤维细胞（尤其是1型）则位于类器官外侧。由于病毒从外表面感染类器官，角质形成细胞的较低病毒载量可能与其感染时间较晚有关。
为进一步验证，我们分析了细胞与类器官表面距离与感染细胞比例及病毒载量之间的关系（补图 S3E+F）。我们将基底层角质形成细胞和乳头型1、2成纤维细胞按与类器官边界的距离分组，并统计每组中至少含有 2 个病毒转录本的细胞比例。结果显示，即使在靠近表面的区域，角质形成细胞中病毒阳性细胞的比例仍低于两种成纤维细胞。
在更深的区域，乳头型1成纤维细胞的病毒阳性比例反而低于2型，这可能是由于其较早感染并开始表现出细胞病变所致。有趣的是，在所有距离段中，基底层角质形成细胞中病毒阳性细胞的病毒载量始终低于相同距离的成纤维细胞。
这些结果表明，基底层角质形成细胞相比真皮中的主要成纤维细胞亚型具有更低的病毒易感性和复制能力，这种差异并非单纯由空间位置决定，而可能由细胞类型本身或其所处的细胞外结构限制所致。
3.5 毛囊减缓病毒传播速度
本研究中使用的皮肤类器官（SkOs）具备多种结构，其中包括含有多种不同来源细胞类型的毛囊（HF）。在真皮中，有一种特定的成纤维细胞亚型——真皮鞘细胞，包裹着外根鞘角质形成细胞和膨大区；而在毛囊底部，则存在另一类成纤维细胞——真皮乳头细胞。毛囊内部的角质形成细胞层包括内根鞘和基质细胞，黑色素细胞也可能嵌入在这些角质形成细胞层中。
当我们分析毛囊中各细胞类型的病毒载量时发现，它们的病毒载量显著低于周围富含病毒 RNA 的乳头型成纤维细胞（图 5A）。即使周围的乳头型成纤维细胞病毒载量极高，毛囊内部的病毒 RNA 水平仍然很低（图 5B）。我们进一步验证这种现象是否仅由毛囊细胞处于组织较内层位置所致，但结果否定了这一假设（补图 4B、C）。
我们提出三种可能的解释：
- 毛囊外部可能存在一圈对病毒不具易感性的细胞层；
- 毛囊可能被一层细胞外基质屏障所保护；
- 毛囊内不同细胞类型的病毒感染周期可能远慢于周围如乳头型成纤维细胞等。
为检验第一种可能性，我们在 4 dpi 时识别了围绕毛囊、邻近高度感染的乳头型成纤维细胞的真皮鞘成纤维细胞（图 5D，补图 S4A）。结果显示，这些真皮鞘细胞的病毒载量相较于外围细胞出现了明显下降（图 5C），而毛囊内部的其他细胞类型病毒载量则更低。
由于我们的空间转录组主实验仅追踪到感染后第 4 天，因此我们回顾了免疫染色数据，以确认在更晚的时间点毛囊是否最终被全面感染。确实，在更晚的时间点毛囊也显示出被感染的迹象（图 5F）。
综上所述，这些结果表明毛囊整体上并非完全不具病毒易感性，但其病毒感染周期明显更为缓慢。
3.6 HSV-1 诱导 TNF 家族细胞因子的层状表达
接下来我们研究了 HSV-1 感染引发的宿主转录组变化。HSV-1 感染不仅会导致宿主基因组转录的广泛关闭（shutoff）[^33]，还会引起转录延伸（read-through）[^34] 和反义转录（antisense transcription）[^35]，但同时也能诱导多个宿主基因表达[^36-39]。
为了识别对病毒感染有反应的宿主基因，我们在不同细胞类型中比较了感染组和未感染组的差异表达，同时考虑病毒 RNA 水平，将细胞分为三类：无病毒 RNA（HSV-1 转录本数 < 2）、低病毒 RNA（病毒载量低于该细胞类型和时间点的中位数）以及高病毒 RNA（高于中位数）。我们重点分析了两个干扰素刺激基因：IRF9 和 MX1，它们已被证实可由 DNA 病毒[^40]和 RNA 病毒[^41]感染诱导表达。
IRF9 的 mRNA 在未感染的类器官中本身就存在较高表达，感染后主要在棘层角质形成细胞中被进一步显著上调（图 6A，上图）。而 MX1 的表达则主要在乳头型成纤维细胞中上调（图 6A，下图）。在 3 dpi，MX1 在亚型 1 中的无病毒细胞和高病毒细胞中均明显上调；在 4 dpi，MX1 在亚型 2 的高病毒细胞中被诱导。这说明 IRF9 和 MX1 的上调在某些细胞中可能是间接作用的结果，比如由旁分泌信号传导介导。
在我们之前的 bulk RNA-seq 实验中，结果显示 4 dpi 时与 TNF 反应相关的基因显著上调（图 3B）。在空间转录组实验中，我们也发现编码 TNFα 的 TNF 基因和编码 4-1BBL 的 TNFSF9 基因在 HSV-1 感染中显著上调。值得注意的是，它们的表达呈明显的细胞类型依赖性，且几乎互不重叠：TNF 主要在角质形成细胞（尤其是基底层）中表达，而 TNFSF9 则在乳头型成纤维细胞中表达（图 6B、E、F）。与 IRF9 和 MX1 不同，TNF 和 TNFSF9 的表达明显依赖于病毒的存在，表达随病毒载量上升而增强，但随后达到峰值后下降，这可能与病毒诱导的宿主转录关闭有关（图 6C、D）。
我们确认这些信号并非来自病毒诱导的转录终止失效导致的“读入式转录”（read-in）[^34]。无论是本研究中的 bulk RNA-seq 数据，还是既往 HSV-1 感染成纤维细胞[^34]与 HaCat 角质形成细胞[^42]的公开数据，都未发现 TNF 和 TNFSF9 上调来自读入效应。相反，这些数据证实 TNFSF9 在成纤维细胞中上调、TNF 在角质形成细胞中上调。此外，我们还在 SkO 模型中观察到由反义转录（如 BBC3）或转录延伸（如 DUX4、CD79A、PECAM1）所导致的基因激活（补图 S5），进一步印证了 HSV-1 感染引发这些异常转录事件。
综上所述，我们观察到在皮肤类器官中 HSV-1 感染诱导了 TNF 家族成员的局部性、层状表达模式。不同细胞类型的空间分布和基因表达反应的特异性，可能形成一种对病毒感染高度协调的细胞因子表达格局。
3.7 TNF 的表达诱导周围细胞中 NF-κB 靶基因的激活
我们进一步研究了 TNF 的表达是否会在其周围细胞中引发功能性响应。首先，我们定义了靠近 TNF 表达细胞的“邻近细胞”（图 7A）。接着，我们基于一项已发表的 RNA-seq 数据集[^43]，筛选出可能由 TNFα 诱导的成纤维细胞基因。在我们进行的空间转录组实验中，有 8 个此类基因被包含在测序面板中（图 7B）。
通过比较靠近 TNF 表达细胞的成纤维细胞与远离者的基因表达差异，我们发现这些基因在邻近细胞中普遍上调，但这种上调在统计上并不显著。随后我们聚焦分析了 CXCL2——一个典型的 TNFα 诱导基因，发现在真皮中临近 TNF 表达角质形成细胞的区域，有大量细胞表达 CXCL2（图 7C）。
为了进一步排除这种现象是否可能由 4-1BBL（即 TNFSF9）诱导，我们又检查了 TNFSF9 表达高但 TNF 表达低或没有的区域。结果发现，在这些区域中，CXCL2 的表达水平明显较低（图 7D）。
综上，我们的研究结果表明：TNF 基因的细胞类型特异性表达可导致 TNFα 细胞因子的分泌，进而诱导其周围邻近细胞中一系列下游靶基因的表达。这一过程可能通过 NF-κB 信号通路介导，体现了病毒感染引发的局部免疫反应的空间协调性。
讨论
在本研究中，我们首次展示了 HSV-1 可感染复杂的人类毛发皮肤类器官（SkOs）。由于这类器官具有“由内向外”的结构，感染从真皮层开始，因此该模型最接近 HSV-1 再激活的情境——即病毒颗粒从神经细胞释放到真皮层的成纤维细胞中[^44]。这使我们的模型在研究 HSV-1 再激活引发的病理过程中具有高度相关性，因为大多数相关疾病是再激活而非初次感染的结果。例如，复发性唇疱疹每年在人群中的平均发病率约为每千人 1.6 例[^45]。此外，皮肤类器官还可用于探索再激活时如何抑制病毒裂解性感染的机制[^46]。
在分析 SkO 模型中不同细胞对 HSV-1 的易感性时，我们发现除角质层、毛囊角化区以及类器官尾部的软骨外，几乎所有细胞类型在感染 10 天（dpi）时最终均被感染。这在缺乏免疫细胞清除感染的情况下是可以预期的。角质层对 HSV-1 的抵抗力已在多项小鼠模型和离体皮肤研究中得到证实：角质层中的角化细胞可有效阻止病毒从外部感染[^6,^9]。不过，离体皮肤研究也表明，通过微针等方式从外部损伤皮肤，仅会导致表皮的轻微感染[^11,^12]。只有通过去除真皮或深层创伤造成病毒从真皮一侧进入，才能有效感染基底层角质形成细胞，并传播至更高分化的角质细胞层[^9,^47]。这进一步强调了表皮的保护作用。目前，我们尚不清楚软骨细胞对病毒的抗性感染原因。由于我们未观察到病毒基因组中的 GFP 报告基因表达，病毒可能在进入阶段就被阻断。未来实验将检验是否由于缺乏病毒受体，或是软骨细胞产生的细胞外基质构成了物理屏障。
为深入了解皮肤模型中的病毒传播与宿主反应，我们开展了空间转录组学分析。我们清晰识别了所有预期的细胞类型，并据此对病毒载量和宿主反应进行了细胞类型与空间定位相结合的分析。这使空间转录组成为研究复杂模型中病毒感染的理想方法。我们识别出多种成纤维细胞和角质形成细胞亚群，它们在病毒载量和宿主反应方面表现出显著差异。乳头状真皮中的成纤维细胞病毒载量远高于基底层和棘层角质形成细胞，说明其产生了更多的感染性病毒颗粒，从而促使 HSV-1 快速在真皮中扩散。而在毛囊中的真皮鞘和真皮乳头成纤维细胞中，病毒载量显著低于邻近乳头状成纤维细胞。离体模型研究表明，尽管真皮成纤维细胞的易感性略低于角质形成细胞[^8,^11]，但此类研究并未区分成纤维细胞亚型。我们模型中缺乏成人真皮中的主要成纤维细胞亚型——网状成纤维细胞，这可能解释了差异。在所有毛囊细胞中，我们观察到病毒感染明显延迟。鉴于毛囊在较晚时间点最终仍被感染，我们排除了这些细胞缺乏病毒受体的可能。我们推测，这种延迟可能是由于病毒基因表达在特定细胞类型中受到限制，尤其是真皮鞘和真皮乳头细胞。此外，毛囊中的角质形成细胞亚群也可能具有一定的抗感染能力，或类似基底层和棘层角质形成细胞一样，病毒基因表达受限。随着空间转录组学等高分辨率技术的发展，未来有望进一步揭示皮肤中病毒传播的动态过程。
基于我们的整体 RNA-seq 数据，我们重点分析了免疫和炎症通路的激活情况，尤其是 TNF 通路，因为其在感染第 4 天被显著上调。我们检测到两种 TNF 家族细胞因子的上调：TNF（编码 TNFα）主要在基底层角质形成细胞中表达，而 TNFSF9（编码 4-1BBL）则在乳头状成纤维细胞中表达。此外，我们观察到 TNF 靶基因在周围细胞中的诱导，以及未感染邻近细胞的预激活现象，说明 TNF 信号通路在类器官中功能活跃。先前的研究也表明 TNF 的表达与 HSV-1 在脑部感染/再激活相关[^48,^49]。我们的结果提示，TNF 家族因子的细胞类型特异性表达，加上皮肤的分层结构，可能启动了空间协调的免疫反应，从而迅速抑制病毒再激活。未来我们将进一步研究 TNF 对病毒基因表达的影响及其对未感染细胞的潜在保护作用。
总之，我们证明了 SkOs 是研究 HSV-1 皮肤感染的高度生理相关模型系统。结合单细胞空间转录组等新兴技术，我们得以前所未有的深度分析病毒的基因表达及宿主反应，这将为皮肤病毒感染研究开辟新路径。
七幅图（Seven Figures）说明的中文翻译：
图 1：SkO 分化特征分析
A. SkO 分化第 -1 天（d-1）至第 120 天（d120）的明场图像。比例尺：500µm。
B. 120 天 SkO 的整体免疫荧光染色（whole mount IF）Z 轴堆叠最大投影图像。比例尺：500µm。
C. 局部放大图像。比例尺：50µm。
标记：KRT17（表皮，毛囊外根鞘）、PDGFRα（真皮成纤维细胞，真皮乳头）、TUBB3（神经细胞，Schwann 细胞）、Hoechst（核染色）、KRT20（Merkel 细胞）、KRT71（毛囊内根鞘）、KRT15（表皮基底层、毛囊外根鞘、髓质）、LHX2（膨大区、毛基质、毛芽、毛斑）、SOX2（真皮凝聚体、真皮乳头、黑色素细胞、Merkel 细胞）、S100β（Schwann 细胞、卫星胶质细胞）、NEFH（感觉神经元，大型胞体神经元）。
图 2：HSV-1 感染 SkOs 导致细胞病变效应
A. 明场（BF）和荧光（GFP）图像：120 天 SkO 未感染与 HSV-1 感染后第 2、4、6、8 天（dpi）。HSV-1 表达 CMV 启动子驱动的 GFP。比例尺：500µm。
B. HSV-1 感染 SkO 的免疫组化（IHC）染色图。总览图中的箭头表示下方高倍区域。比例尺：总览图 500µm，放大图 20µm。
放大图：上图展示左侧为表皮、右侧为真皮，中间为基底层；下图显示毛囊区域。
染色标记：H&E（苏木素-伊红染色）、GFP（HSV-1 表达的 GFP）、gD（HSV-1 糖蛋白 D 抗体染色）。
图 3：HSV-1 感染 SkOs 的整体转录组分析
A. 火山图显示第 2、4、6、8 dpi 与未感染 SkO 相比的宿主基因差异表达情况。
B. 使用 WebGestalt 工具对 RNA-seq 显著差异表达基因（padj ≤ 0.05，log2FC ≥1/≤-1）进行 GO 分析，显示显著富集的 GO 术语中前 10 个富集比最高的项目（FDR ≤ 0.05），并按生物功能分类。
C. 映射到 HSV-1 的读取百分比（未感染、2、4、6、8 dpi），每个柱代表一个重复。
图 4：HSV-1 感染皮肤类器官的空间转录组分析
A-B. 显示未感染（A）和感染第 3 天（B）的部分区域，细胞按细胞类型着色。
C-D. 与 A-B 相同区域，但按所示基因的表达水平着色。
E. 各时间点所选细胞类型的相对丰度。细线表示每个时间点三个类器官之间的标准差，颜色同 A-B。
F. 上图：所选细胞类型中每种至少检测到 2 个 HSV-1 转录本的细胞百分比，显示三重复和标准差；下图：病毒载量的 log10 转换分布（按病毒转录本百分比）。箱线图中线表示中位数，箱体为四分位间距，须为 1.5 倍 IQR，离群值为点状。
G. 至少含有 2 个病毒转录本的细胞按载量排序，每 20 个为一组，展示每组中两种病毒基因（转录本）在乳头型 1 成纤维细胞（左）和基底层角质形成细胞（右）中的百分比。
图 5：毛囊对病毒感染表现出更高的抵抗力
A. 毛囊中各细胞类型与乳头型 1/2 成纤维细胞的病毒载量比较。
B. HSV-1 UL54 在毛囊周围的表达情况。左图为未感染类器官片段，右图为第 4 天感染样本。上排：按细胞类型着色，标出毛囊细胞类型；下排：按 HSV-1 UL54 正规化表达量着色。橙色圈出区域为靠近高度感染的乳头成纤维细胞的真皮鞘。
C. 真皮鞘细胞通过其邻近（50μm 细胞，右边为毛囊内 >50μm 细胞。
D. Xenium 载玻片上的 DAPI、细胞表面蛋白和内部蛋白染色，橙蓝圈出为 B 中真皮鞘细胞。
F. 对感染类器官在各 dpi 时间点切片，使用抗 HSV-1 gD 的免疫组化染色。
图 6：细胞类型特异性的细胞因子诱导
A-B. 所示基因在选定细胞类型中的表达值。未感染和 2dpi 的样本按所有细胞合并，3dpi 和 4dpi 分为三组：无或仅 1 个病毒计数（-），病毒载量低于中位数（+），高于中位数（++）。中位数基于有 >1 个病毒计数的细胞计算。点的大小表示至少有一个基因计数的细胞比例，颜色表示平均表达量。黑圈表示伪总体分析中与未感染细胞显著不同。
C-D. 至少含有 2 个病毒计数的细胞按病毒载量排序，每 20 个为一组，展示 stratum basale 角质形成细胞（B）和乳头 1 型成纤维细胞（C）中 TNF、TNFSF9 和 HSV-1 UL54 在组内的百分比。
E-F. 显示第 4 天感染 SkO 的一部分，E 按细胞类型着色，F 按所示基因的表达水平着色。
图 7：TNF 诱导导致靶基因在邻近区域表达
A. 显示第 4 天感染 SkO（图 S3 左上角）。细胞着色为：TNF 表达细胞群（蓝色）、邻近其的细胞（红色）、其他（绿色）。
B. 在 TNF 表达细胞邻近与远离区域的成纤维细胞中，TNF 靶基因的差异表达分析。
C. 图 6F 中的区域展示 CXCL2 表达情况（TNF 表达细胞用红色圈出）。
D. 来自另一第 4 天感染类器官的相似区域，含 TNFSF9 表达细胞，但未导致明显的 CXCL2 表达增强。
离体皮肤模型（ex vivo skin model）vs SkO 模型（皮肤类器官模型，skin organoid model）
离体皮肤模型 vs SkO 模型
🔬 1. 来源与组成
离体皮肤模型（Ex vivo skin model）
- 来源于人或动物的真实皮肤组织（如外科切除组织或尸体样本）
- 保留完整的表皮、真皮结构，有时还包含血管、汗腺等附属结构
- 含有成熟的细胞类型，如角质形成细胞、成纤维细胞等
SkO 模型（Skin Organoid model）
- 来源于人类干细胞（如 hESC 或 hiPSC）体外诱导发育而成
- 形成类似发育过程的结构，包含毛囊、真皮、表皮等皮肤层次
- 含有多个皮肤相关细胞亚型，但为体外诱导生成，不等同于天然皮肤
🧪 2. 实验特性
离体皮肤模型
- 属于非活体组织，无法长期培养，活性快速衰退
- 有时包含部分免疫细胞，但功能受限
- 个体来源不同，样本间差异较大，不利于标准化研究
SkO 模型
- 可长期培养，模拟发育过程，近似“类活体”组织
- 不含天然免疫细胞，但可外源加入
- 由同源细胞诱导形成，重复性好，适合可控性强的系统性研究
🦠 3. 在 HSV-1 感染研究中的应用
离体皮肤模型
- 适合研究初次感染，病毒需通过表皮进入
- 感染效率通常依赖于是否有表皮创伤（如微针）
- 不易识别细胞亚型的感染差异
SkO 模型
- 更贴近 HSV-1 再激活过程，模拟病毒从真皮层渗透
- 结构允许较深层细胞感染，效率更高
- 可结合空间转录组技术识别不同细胞亚型对病毒的易感性与响应
🧬 4. 扩展性与应用场景
离体皮肤模型
- 来源有限，难以进行高通量筛选
- 难以与其他系统（如神经系统）联合模拟
SkO 模型
- 易于标准化和规模化制备，适合药物筛选和基因功能研究
- 有潜力与脑类器官联合建立“神经-皮肤轴”模型，研究病毒再激活过程
✅ 总结
- 离体皮肤模型更接近真实皮肤组织，但实验周期短、可控性差
- SkO 模型代表一种新型的、可扩展的皮肤系统研究平台，特别适合病毒传播机制和宿主响应的系统性研究
