CRISPR-Cas9 脱靶率检测方法
问题背景
在通过电转（Electroporation）结合 CRISPR-Cas9 技术完成蛋白敲除后，评估脱靶率（off-target rate）是关键步骤。脱靶率指 Cas9 在非目标位点发生切割导致的意外变异比例。以下为回答“简单测序方式（如 pool 测序）”的建议，重点推荐多位点扩增结合 NGS（amplicon deep sequencing），并澄清 pool 测序的概念。
推荐方法：多位点扩增 + NGS（Pool 测序）
什么是 Pool 测序？
在 CRISPR 脱靶检测中，pool 测序指：
- 使用预测工具（如 CRISPOR、Cas-OFFinder）筛选潜在脱靶位点（通常几十到上百个）。
- 针对这些位点（包括目标位点）进行 PCR 扩增（片段约 200–300 bp）。
- 将所有扩增产物混合（pool）成一个测序文库，使用 NGS（如 Illumina，150 bp 读长）测序。
- 通过分析每个位点的 reads，计算 indel 率（插入/缺失比例），即脱靶率。
为什么选它？
- 简单：流程标准，实验室常用，操作直观。
- 成本低：多个位点混库测序，远低于全基因组测序。
- 结果直观：直接报告每个位点的 indel 率（如“位点A：0.5%”）。
- 可优化：加入 UMI（唯一分子标签）可减少 PCR 偏差，提高低频脱靶检测精度。
操作步骤（概念版）
- 用 CRISPOR 或 Cas-OFFinder 预测脱靶位点。
- 设计引物，针对每个位点 PCR 扩增。
- 混合扩增产物，构建 NGS 文库。
- 上机测序，分析每个位点的 indel 率。
注意事项
- 位点局限：仅覆盖预测位点，漏掉意外脱靶。需结合 GUIDE-seq 或 CIRCLE-seq 发现位点。
- 测序深度：检测 <0.1% 低频脱靶需更高深度，增加成本。
- 细胞背景：电转细胞类型可能影响脱靶谱，建议用实际样本验证。
其他方法（更全面）
如果担心漏检，可先用以下方法发现脱靶位点，再用 pool 测序定量：
- GUIDE-seq：细胞内用寡核苷酸标记双链断裂，测序定位。优点是贴近真实环境，适合安全性评估。
- CIRCLE-seq/CHANGE-seq：体外切割基因组 DNA，富集后测序，灵敏度高，适合生成候选位点清单。
Pool 测序 vs. 群体遗传学 Pool-seq
- CRISPR 的 Pool 测序：同一样本内多个位点的扩增产物混合测序，保留样本信息，适合脱靶率分析。
- 群体遗传学的 Pool-seq：混合多个个体 DNA 测序，研究群体变异，丢失个体信息，不适合单个样本的脱靶检测。
电转结合 CRISPR-Cas9 敲除原理
- 电转：通过高压电场在细胞膜上开孔，将 Cas9 蛋白和 sgRNA（或 RNP 复合物）导入细胞。
- CRISPR-Cas9：sgRNA 引导 Cas9 切割目标基因，造成双链断裂（DSB）。
- 敲除：细胞通过非同源末端连接（NHEJ）修复，常产生 indel，导致基因失活，蛋白表达消失。
结论
多位点扩增 + NGS（Pool 测序）是最简单、性价比高的脱靶率检测方法，适合快速验证预测位点的编辑率。如需更全面分析，可结合 GUIDE-seq 或 CIRCLE-seq 发现意外位点，再用 pool 测序定量。
CRISPR 脱靶检测方法对比表
以下表格比较了 多位点扩增NGS（Amplicon-NGS，即 Pool 测序）、GUIDE-seq、CIRCLE-seq 和 全基因组测序（WGS） 在检测 CRISPR-Cas9 脱靶率时的特点，供快速选择适合方法。
| 方法 | 原理 | 优点 | 局限 | 适用场景 |
|---|---|---|---|---|
| Amplicon-NGS (Pool 测序) | 针对预测位点 PCR 扩增，混合建库，NGS 测序计算 indel 率 | – 成本低 | ||
– 操作简单，流程成熟 – 结果直观（位点 indel%） |
– 仅限预测位点 – 无法发现意外脱靶 – 低频脱靶需高测序深度 |
快速验证已知位点的脱靶率；常规研究 | ||
| GUIDE-seq | 细胞内用寡核苷酸标记 Cas9 双链断裂，全基因组测序定位 | – 贴近真实细胞环境 | ||
– 能发现意外脱靶 – 对低频位点较敏感 |
– 实验较复杂 – 某些细胞类型效率低 |
安全性评估；需全面发现脱靶的研究 | ||
| CIRCLE-seq | 体外基因组 DNA 环化，暴露 Cas9 切割，富集后测序 | – 灵敏度高 | ||
– 操作较 GUIDE-seq 简便 – 易发现低频/意外位点 |
– 体外体系，可能与细胞内偏差 – 需细胞样本验证 |
生成广谱候选位点清单，结合验证 | ||
| WGS | 高深度全基因组测序，观察全局变异 | – 覆盖全面 | – 成本高 | |
– 对低频脱靶敏感度低 – 数据分析复杂 |
临床级严谨需求；补充验证 |
决策建议
- 简单需求：选 Amplicon-NGS，快速定量已知位点脱靶率。
- 全面需求：先用 GUIDE-seq 或 CIRCLE-seq 发现位点，再用 Amplicon-NGS 验证和定量。
- 高严谨性：WGS 作为补充，但成本较高。
回答：CRISPR-Cas9 敲除后脱靶率检测的简单测序方法
关于用电转结合CRISPR-Cas9敲除蛋白后，想知道脱靶率的简单测序方法，我推荐用多位点扩增结合NGS（amplicon deep sequencing），也就是您提到的“pool测序”。下面我简单说明怎么做，以及为什么它简单有效：
1. “Pool测序”是什么？
在这里，pool测序指的是：
- 先用工具（如 CRISPOR、Cas-OFFinder）预测 Cas9 可能切错的脱靶位点（通常几十到上百个）。
- 对这些位点（包括目标位点）做 PCR扩增，每个位点扩增出 200–300 bp 的片段。
- 把所有扩增产物混合（pool）成一个测序文库，上机测序（比如 Illumina，150 bp 读长就够）。
- 测序后，通过分析每个位点的 reads，计算 indel率（插入/缺失比例），这就是脱靶率。
2. 为什么选它？
- 简单：实验流程成熟，很多实验室都用这套方法，操作像“套公式”一样直观。
- 省钱：几十个位点混在一个文库里测，成本远低于全基因组测序。
- 结果直观：直接告诉你每个位点的脱靶率（比如“位点A：0.5% indel”）。
- 可优化：加 UMI（唯一分子标签）能减少 PCR 偏差，检测低频脱靶更准。
3. 注意事项
- 位点选择：脱靶率分析只覆盖你预测的位点。如果担心漏掉意外脱靶，可以先用 GUIDE-seq 或 CIRCLE-seq 找候选位点。
- 测序深度：想看 0.1% 以下的低频脱靶，得增加测序深度，稍微多花点成本。
- 细胞背景：电转的细胞类型可能影响脱靶谱，建议用你的实际样本测。
4. 简单操作步骤（概念版）
- 用软件预测脱靶位点（几十到上百个）。
- 设计引物，针对每个位点 PCR 扩增。
- 把扩增产物混在一起，建 NGS 文库。
- 上机测序，分析每个位点的 indel 率。
5. 如果想更全面？
如果您担心预测位点不全，可以先做：
- GUIDE-seq：细胞内，贴近真实环境，发现意外脱靶。
- CIRCLE-seq 或 CHANGE-seq：体外，超高灵敏度。 这些方法能找到潜在脱靶位点，再用 pool 测序定量验证。
6. 小结
Pool测序（多位点扩增NGS）是最简单、性价比最高的脱靶率检测方法，特别适合您现在的情况。如果您有目标基因和 sgRNA 序列，我可以帮您整理更具体的位点预测或实验设计思路！您觉得需要更详细的方案吗？