Part A｜把你“125 的流程”迁移到 CP052959.1 的 step-by-step（中文）
0️⃣ 目录结构建议（最省事）
新建一个工作目录，例如：
HD46_GuideFinder/
CP052959.1.gbk
CP052959.1.fna
extract_cds_from_gbk.py
PreProcessing_HD46.R
GuideFinder_HD46_base.R
ScanOfftarget_HD46.R
(可选) *.Rmd你可以把你当时的
PreProcessing_125.R/GuideFinder_125_base.R/ScanOfftarget_125.R复制一份改名，然后把里面所有 “125” 的文件名前缀改成 “HD46” 或 “CP052959.1”。
1️⃣ 从 GenBank 提取 CDS → 生成 HD46_CDS.fasta（Python + Biopython）
输入： CP052959.1.gbk
输出： HD46_CDS.fasta（每个 CDS 一条序列，header 用 locus_tag）
运行（示例）：
python extract_cds_from_gbk.py \
--gbk CP052959.1.gbk \
--out HD46_CDS.fasta检查输出里应该能看到类似：
>HJI06_09100 ...>HJI06_09105 ...
这一步的目的：后面要把每条 CDS 用 BLAST 定位回整条基因组，得到统一的坐标表（尤其适配 draft genome / 多 contig 的情况；complete genome 也能这么跑，流程统一）。
2️⃣ Pre-processing：把 CDS BLAST 回基因组 → 生成 gene coordinate table
2.1 建 BLAST 数据库（GenomeDB）
用基因组 FASTA 建库（输入 CP052959.1.fna）：
makeblastdb -in CP052959.1.fna -dbtype nucl -out GenomeDB_HD462.2 BLAST：CDS vs Genome
（你笔记里用的是 -task blastn，这里沿用；如果你 CDS 很短也可用 blastn-short）
blastn -task blastn \
-query HD46_CDS.fasta \
-db GenomeDB_HD46 \
-outfmt "6 qseqid sseqid sstart send sstrand length pident bitscore" \
-max_target_seqs 1 \
-perc_identity 95 \
-out CDS_vs_genome_HD46.blast2.3 生成坐标表
运行你改好的预处理脚本（对应你笔记里的 PreProcessing_125.R）：
Rscript PreProcessing_HD46.R
# 或者
Rscript -e "rmarkdown::render('PreProcessing_HD46.Rmd')"输出： HD46_gene_coordinates.tsv
这张表通常会包含每个基因（locus_tag）的：
- contig/seqid（这里应该是 CP052959.1）
- start/end
- strand
- （如果脚本计算了）promoter 区、TSS 近似位置、gene length 等
3️⃣ Guide 设计：跑 GuideFinder（或你简化版 GuideFinder-like 脚本）
你笔记里分成：
GuideFinder_125_base.R：做 PAM 扫描、GC/同聚物过滤、计算 dist_to_tss、写出待 BLAST 的 guides fasta- 然后再
ScanOfftarget_125.R：根据 BLAST 命中做 off-target 分层（off_n3/off_n5/off_refined）
我建议你按同样分法跑（更清晰、也更容易 debug）。
3.1（可选但很推荐）只做 TA 这两个基因：建 targets 列表
新建 TA_targets.txt：
HJI06_09100
HJI06_09105然后在 GuideFinder 脚本里加一个“只保留这两个基因”的过滤（如果你当时 125 是全基因组，这里就能显著加速）。
3.2 运行 base 设计脚本
Rscript GuideFinder_HD46_base.R你期望它会做：
- 扫 NGG PAM、生成 20bp（或 20/21/22）候选
- GC / homopolymer / bad-seed / restriction-site 过滤
- 正确计算
dist_to_tss（你笔记里写这次修好了） - 写出
BLASTguides.fasta并跑 BLAST（或至少准备好 BLAST 输入） - 产生一个“preoff”的 guides 表（比如
HD46_guides_preoff.tsv）
3.3 Off-target 扫描与分层输出
Rscript ScanOfftarget_HD46.R它会把结果放进类似这样的目录结构（沿用你笔记习惯）：
scan_results/
off_n3/
guides_all.tsv
guides_top5.tsv
off_n5/
guides_all.tsv
guides_top5.tsv
off_refined/
guides_all.tsv
guides_top5.tsvPart B｜你要用 off_refined 的“选择逻辑”怎么理解（中文）
你笔记里这段非常关键，我用更直白的方式总结一下（保持你原有意图）：
1) 现在脚本里的 n_hits 统计是什么？
- 目前
n_hits是“guide 的 BLAST 命中次数”，不区分 promoter / CDS / intergenic - 也不检查命中位点是否旁边有 NGG PAM
- 因此它会偏“保守”（宁可把一些其实没有 PAM 的匹配也算作潜在风险）
2) off_refined 策略核心是什么？
你笔记里这句说得很到位：
- off_refined 已经在 BLAST level 上把真正危险的“第二个完美 20/20 命中”踢掉了
- 剩下的 guide 通常是“1 个 on-target + 一堆残缺 off-target”（比如 mismatch 多、seed 不完整等），更接近你理想的“只在目标位点真正起作用”
3) 你提出的“只把有 PAM 的命中算 off-target”是对的
从 dCas9/Cas9 生物学机制看：
- 没有合适 PAM（这里是 NGG），多数情况下不构成真实 off-target 风险
- 你可以在后续加一层：对每个 BLAST 命中回到 genome 取邻域序列，检查是否存在 NGG，再把“有 PAM 的命中”纳入 n_hits
但就你现在说的用途（实际做 CRISPRi 设计），off_refined 已经是很实用的默认档位。
Part C｜给 Xxxxxx 的邮件草稿（你直接复制粘贴就能发）
你要“写一封邮件给 Xxxxxx，说原理上可行，并做了一个 probe-test；最佳匹配 Enterobacter intestinihominis…；用 off_refined；解释结果；并附算法细节；附件 guides_all.tsv / guides_top5.tsv”。 我下面给英文邮件（更像工作邮件）。你把方括号里的占位符替换成你的具体数字/文件名即可。
Hi Xxxxxx,
In principle the guide design pipeline is working end-to-end now. I ran a small probe-test on Patricia’s previously assembled complete isolate “125” genome input.
Quick taxonomy sanity check (PATRIC/closest match): Best match: Enterobacter intestinihominis (taxid = 3133180; species; lineage: Bacteria → Pseudomonadati/Pseudomonadota → Gammaproteobacteria → Enterobacterales → Enterobacteriaceae).
What the pipeline produced (strategy: off_refined):
- It completes the sequence-level filters (GC + homopolymers) and computes
dist_to_tsscorrectly. - It then runs a BLAST-based off-target scan and generates the final guide tables.
-
Attached are:
guides_all.tsv(all guides passing filters)guides_top5.tsv(up to 5 best guides per gene)
Summary of the results (off_refined):
- Total genes evaluated: [N_genes]
- Genes with ≥1 guide: [N_with_guides] ([pct]% coverage)
- Genes without guides: [N_without_guides]
- Total guides retained in
guides_all.tsv: [N_guides_all] - Median guides per gene (genes with guides): [median_guides_per_gene] (These numbers are from the attached tables.)
Algorithm details (off_refined, in plain terms):
- Candidate generation: scan for NGG PAM sites and create guide candidates (20 bp; optionally 21/22 bp depending on settings).
- Primary filters: remove candidates failing GC threshold and basic sequence-quality rules (e.g., long homopolymer runs; optional “bad-seed” motifs / restriction sites).
- TSS proximity scoring: compute
dist_to_tssand prioritize guides closer to the inferred transcription start region for CRISPRi. - Off-target screening via BLAST: align guide (or seed region, depending on mode) against the whole genome.
- off_refined rule: discard any guide that shows a second perfect full-length match elsewhere in the genome (i.e., another 20/20 hit besides the intended on-target). The remaining guides typically have 1 on-target hit plus only weak/partial off-target hits.
Note: in the current implementation, n_hits is counted genomewide from BLAST hits (no promoter/CDS distinction and no explicit PAM check at hit sites), which is conservative. If needed, we can further refine by counting only BLAST hits that also have an appropriate NGG PAM in the correct context.
Best, Yyyy
如果你接下来要把这个流程用到你真正关心的 HD46（CP052959.1）TA 单元，我建议你按上面 Part A 跑完后，把 scan_results/off_refined/guides_top5.tsv 里 HJI06_09100 和 HJI06_09105 的行贴出来，我可以再帮你快速做“最终挑哪 1 条单 guide / 哪一对 paired guides 最适合用来一起 knockdown 这个 TA 单元”的二次筛选。