!!!!! Good candidate for the workshop for the clinicians !!!!!

ps_* object	What it contains	Taxonomic composition	Alpha diversity	Beta diversity	DESeq2 differential abundance
ps_raw	Raw imported phyloseq object (integer counts; as imported)	❌ (not recommended directly)	❌	❌	⚠️ only if you also apply sample filtering first
ps_base	ps_raw + taxonomy + sample metadata aligned (still raw counts)	❌	❌	❌	⚠️ only if you also apply sample filtering first
ps_pruned	Optional subset of ps_base (e.g., remove unwanted samples by ID/pattern); still raw counts	❌	❌	❌	⚠️ only if you also apply low-depth filtering
ps_filt	Filtered samples (low-depth samples removed) + taxa with nonzero totals; absolute counts	✅ as a starting point (but plot on ps_rel)	✅ as the input to rarefaction	✅ as the input to rarefaction	✅ as the input to ps_deseq
ps_rel	Relative abundance (compositional) computed from ps_filt	✅ primary	❌	❌	❌
ps_abund	Absolute counts after “plotting taxa filter” (e.g., mean rel. abundance > 0.1%), derived from ps_filt via ps_rel	✅ (if you want cleaner plots)	❌	❌	❌ (not recommended)
ps_abund_rel	Relative abundance computed from ps_abund (filtered taxa set)	✅ (clean composition plots)	❌	❌	❌
ps_rarefied	Rarefied counts from ps_filt (even depth)	❌	✅ primary	✅ primary	❌
ps_deseq	Non-rarefied integer counts from ps_filt + optional count-based taxon prefilter (e.g., total ≥ 10)	❌	❌	❌	✅ primary

这里说“证据链没有闭环”，不是否定结果，而是从审稿人最严格的因果标准来看，ΔadeIJ 这条线目前更像“相关性很强 + 合理推断”，但还缺少几步能把“推断”锁死成“因果”的关键证据。

1) 目前已有的证据（强相关）

• 表型：ΔadeIJ 的 ROS 更高，对 Cu²⁺ / SNP 更敏感
• 转录组：ΔadeIJ 上调金属外排/解毒/应激相关基因

因此很自然会推断：

AdeIJ 参与金属/氧化应激稳态（redox & metal homeostasis）

这属于 “一致性证据（consistent with）”，说服力已经很不错。

2) 为什么说“还没闭环”：少了把“推断 → 因果”钉死的步骤

审稿人可能会问：
“你怎么证明是 缺失 AdeIJ 导致金属/ROS 失衡，而不是其他原因？”

通常闭环至少需要补上一类证据（不一定要做，但逻辑上缺）：

A. 互补实验（complementation / rescue）

理想闭环：

• ΔadeIJ 表型变差
• 把 adeIJ（或 adeIJK）补回去 → ROS/Cu²⁺/SNP 表型恢复到 WT（rescue）

没有这一步，审稿人可能会担心：

• 极性效应（polar effect）
• 二次突变（secondary mutation）
• 背景差异（background effects）

B. 直接测量“因果中间量”（mechanistic intermediate）

你们推断的是“金属/毒性底物积累 → ROS 上升 → Cu²⁺/SNP 敏感”。
但目前缺少对“中间量”的直接测量，例如：

• 细胞内 铜含量 是否在 ΔadeIJ 增加（ICP-MS/比色法等）？
• 是否有更明确的蛋白氧化损伤/Fe–S 破坏指标？
• 是否存在呼吸链/膜电位异常导致 ROS 增加？

目前是“结果（ROS 高）+ 反应（相关基因上调）”，但还没直接证明“金属积累/底物积累”这一环节。

C. 排除替代解释（alternative explanations）

ΔadeIJ 的高 ROS 也可能来自：

• 代谢状态改变导致呼吸链泄漏增加
• 生长状态差异影响 ROS 测定
• Cu²⁺ 敏感来自包膜改变而非金属外排不足

如果未排除，结论更适合写成 consistent with，而非 crucial determinant。

3) “闭环”长什么样（最理想的因果链）

AdeIJ 缺失
→ 细胞内金属/毒性底物积累（直接测到）
→ ROS 上升（你们已测到）
→ Cu²⁺/SNP 敏感（你们已测到）
→ 补回 adeIJ 后表型恢复（rescue）

这就是“证据链闭环”。

4) 对写作的建议（不一定要加实验）

投稿时完全可以不补实验，但建议在文字上更稳健：

• 避免：“AdeIJ is crucial/essential for maintaining …”
• 推荐：
  • “These data support / are consistent with a role for AdeIJ in …”
  • “We suggest AdeIJ contributes to …”
  • “Further work (e.g., complementation or intracellular metal quantification) would be needed to establish causality.”