1. 针对第 9、10、11 组以及混合的 pre-FMT 组的 PCA 和多样性分析
   筛选条件：Group 9（J1–4, J10, J11）、Group 10（K1–K6）、Group 11（L2–L6）以及 pre-FMT（G1–G6, H1–H6, I1–I6）
   1.1 这些组之间在 α 多样性或 β 多样性方面是否存在显著差异？你能否为此生成一个 PCoA 图？
   1.2 在仅比较第 9、10 和 11 组时，α 多样性或 β 多样性之间是否存在显著差异？你能否也为此生成一个 PCoA 图？
   1.3 第 9 组与第 10 组之间有哪些差异表达的基因（DEGs）？
   1.4 第 9 组与第 10 组之间是否存在差异富集/差异表达的通路？
   1.5 你是否可以使用 R 绘制一棵系统聚类树（树状图），包含数据集中检测到的所有细菌科（bacterial families）？我附了一篇论文作为示例（Figure 1C）。

2. Group 3 与 Group 4 之间的通路分析
   筛选条件：Group 3：C1–C7；Group 4：E1–E10。
   是否可以请你对 Group 3 vs Group 4 做一次通路分析？

3. 2022 年数据集（第一组筛选条件）
   筛选条件：Group 1：1, 2, 7, 6；Group 5：29, 30, 31。
   这些组之间在 α 多样性或 β 多样性方面是否存在显著差异？你能否为此生成一个 PCoA 图？
   有哪些 DEGs？
   是否存在差异富集/差异表达的通路？

4. 2022 年数据集（第二组筛选条件）
   筛选条件：Group 1：1, 2, 7, 6；Group 5：29, 30, 31；Group 2（不加筛选）；Group 6（不加筛选）。
   这些组之间在 α 多样性或 β 多样性方面是否存在显著差异？你能否为此生成一个 PCoA 图？

5. 微生物组分析的方法部分
   我们已经写好了材料和方法部分，其中包含微生物组分析的内容，我已将这一部分附在邮件中。你有没有什么意见？特别是你认为是否还需要补充描述 QC（质控）分析的内容？

   Microbiome analysis（微生物组分析）
   在所示时间点，于上午 9–10 点之间采集小鼠粪便样本，并立即在 -80°C 冻存直至使用。DNA 提取使用 QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen, #51604），并根据已发表的小鼠粪便专用方案进行操作⁸。简而言之，粪便颗粒在 Precellys® 24 匀浆器（Bertin Technologies）中、使用 Soil grinding tubes（Bertin Technologies, #SK38）进行均质处理，随后按照试剂盒说明书提取 DNA。通过 Nanodrop 测定 DNA 产量，并将浓度调至 10 ng/µl。16S rRNA 扩增子（V3–V4 区域）采用带有 Illumina 接头通用序列的简并引物进行扩增：前向引物 F（5′- TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′），反向引物 R（5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGG-TATCTAATCC-3′），具体方法参考已发表的方案⁹,¹⁰。随后使用 Illumina Nextera XT Index Kit（Illumina, #FC-131-1001）对样本进行多重上样，构建带条形码的文库。文库在 MiSeq 平台（Illumina, #MS-102-2003）上进行 500PE 测序。

   QC
   不同组之间微生物群落组成的差异使用 PERMANOVA（置换多元方差分析）进行评估，基于 R 包 vegan 中的 adonis 函数，设置 9999 次置换。该分析基于 Bray–Curtis 距离矩阵，该矩阵综合考虑了物种的有无以及各物种在每个样本中的相对丰度。该方法用于评估不同组之间整体群落组成是否存在显著差异。
   群体间的差异丰度分析使用 R 包 DESeq2 完成，该方法通过负二项式广义线性模型对计数数据进行建模¹¹。在气泡图中，x 轴表示相对丰度的 log₂ 倍数变化，每个气泡代表一个 OTU，气泡颜色表示其所属的细菌目（bacterial order），气泡大小表示经过 Benjamini–Hochberg 校正后的调整 p 值。

6. 关于 PCoA 和 PCA 的问题
   我们目前还不是完全确定你所做的分析是主坐标分析（PCoA）还是主成分分析（PCA）。你能否就此再给一些说明或评论？

1. 第 9、10、11 组及混合 pre-FMT 组的 PCA 和多样性分析
   你之前已经向我们展示过，这些组在 α 多样性和 β 多样性方面存在显著差异。我们能否据此得出结论：每一组在 α 和 β 多样性上都与所有其他组显著不同？如果不能，是否可以做一个事后检验（例如 Bonferroni 校正的 post-hoc 分析），来查看哪些组在 α 或 β 多样性上存在显著差异？在这里，我们主要感兴趣的比较是：9 vs 10，9 vs 11，10 vs 11。

2. 通路分析：第 9 组 vs 第 10 组
   是否可以预先筛选我们感兴趣的通路？在这里，我们特别想关注参与短链脂肪酸（SCFAs）生成的相关通路。这个在分析上可行吗？你对这样的做法有什么看法或建议？

3. 2022 年数据集：第 1、2、5 和 6 组
   在第 1 组和第 5 组之间，是否能检测到任何差异表达基因（DEGs）？
   你之前已经向我们展示过，第 1、2、5 和 6 组之间在 β 多样性上存在显著差异。结合我在第一个问题中的疑问：这些组在 β 多样性上是否彼此之间都显著不同，还是说我们需要进行事后分析（post-hoc）来判断具体是哪些组之间存在显著差异？在这里，我们主要关心的比较是 1 vs 5 和 2 vs 6。你能帮我们一起解读这些结果吗？

    ~/Tools/linuxnd/lnd login -u 登录账号 -p 登录密码
    ~/Tools/linuxnd/lnd list
    ~/Tools/linuxnd/lnd list oss://[First_1_part_of_数据路径]
    ~/Tools/linuxnd/lnd cp -d oss://  ./                           #-->ERROR
    #The following two commends download the same datasets, only the first one have two tiers of directories H**************2/R*****4
    #NOTE that next time downloading once is enough!
    ~/Tools/linuxnd/lnd cp -d oss://[First_1_part_of_数据路径] .
    #~/Tools/linuxnd/lnd cp -d oss://[First_3_parts_of_数据路径] .

    cd [Target_directory_containing MD5.txt]
    cp MD5.txt md5sum_check.txt
    ~/Scripts/check_md5.sh