DOI: https://doi.org/10.3390/biology14091201
引用: Foong, W.E.; He, W.; Xiang, X.; Huang, J.; Tam, H.-K. 基因组和表型表征揭示药物敏感鲍氏不动杆菌表现出增强的毒力相关性状和应激耐受性. Biology 2025, 14, 1201.
1 生物化学与分子生物学系，衡阳医学院，南华大学，衡阳 421001，中国; wuenee@hotmail.com (W.E.F.)
2 医学微生物学系，湖南省特殊病原体防控重点实验室，衡阳医学院，南华大学，衡阳 421001，中国
3 国家卫生健康委员会出生缺陷研究与预防重点实验室，湖南省妇幼保健院，长沙 410008，中国
4 医学微生物学、病毒学和卫生学研究所，汉堡-爱泼斯坦大学医学中心，马丁街52号，20246 汉堡，德国
- 通讯作者: j.huang@uke.de (J.H.); tamhk60@hotmail.com (H.-K.T.)
简单摘要
鲍氏不动杆菌通常因其对抗生素的抗性而在医疗环境中构成严重威胁。在本研究中，我们调查了一个临床分离株 HKAB-1，尽管对多种抗生素高度敏感，但表现出显著的毒力相关性状。相比参考株 ATCC 19606，HKAB-1 在血清和干燥条件下显示出增强的存活能力。HKAB-1 还形成坚固的生物膜并表现出更大的运动性，这些表型与持久性和致病性相关。基因组和转录组分析显示，HKAB-1 拥有活跃的铁获取和血红素利用系统，这些系统对类似宿主条件高度响应。此外，我们发现与生物膜形成相关的基因在形成生物膜的细胞中高度诱导。相反，adeB 的表达显著降低，这可能解释了尽管拥有多个抗性基因仍表现出抗生素敏感性的原因。这些发现反映了某些鲍氏不动杆菌菌株在进化上的权衡，优先考虑毒力相关性状而非抗菌机制的表达。这一结果凸显了持续基因组监测的必要性，以监控类似 HKAB-1 这样新兴的毒力强但药物敏感的菌株，这些菌株可能在选择压力下作为抗性发展的储备。
摘要
鲍氏不动杆菌是一种机会性病原体，以其多药抗性和环境持久性而著称。我们表征了一个临床分离株 HKAB-1，尽管对所有测试的抗生素高度敏感，但表现出显著的毒力相关性状。HKAB-1 在 MH2B、血清和干燥条件下表现出优越的生长，形成了坚固的生物膜，并具有活跃的运动性。全基因组测序确定了两个血红素利用簇、多个铁载体生物合成途径以及其他毒力相关基因。基因表达分析显示，在血清暴露下，血红素利用和铁载体生物合成基因簇显著上调，表明在类似宿主条件下铁摄取途径的激活。生物膜相关基因，包括 bap、PNAG 生物合成基因和 IV 型菌毛成分，在形成生物膜的细胞中显著上调，支持其在驱动增强生物膜表型中的作用。相反，编码主要 RND 外排泵的 adeB 显著下调，可能解释了其药物敏感表型。比较基因组分析凸显了与营养运输、代谢途径和膜生物生成相关的基因差异，这些差异可能支撑其增强的生长。这些发现指向抗生素抗性和毒力之间的潜在权衡，强调监测抗生素敏感但高度毒力的鲍氏不动杆菌分离株作为抗性进化的潜在储备的重要性。需要进一步调查以阐明这种表型平衡的潜在机制。
关键词: 鲍氏不动杆菌; 血红素利用; 毒力; 血清抗性; 干燥耐受性
1. 引言
鲍氏不动杆菌是临床环境中其属中最常分离的物种，已成为研究多药抗性 (MDR) 的模型生物 [1]。近年来，该病原体对全球医疗系统构成了日益严重的威胁；该病原体引起多种严重的医院感染，包括呼吸道、皮肤、尿路、伤口和血流感染 [2]。该细菌在医疗环境中的持久性很大程度上归因于其在干燥、消毒剂和抗菌药物长期暴露等恶劣条件下的惊人耐受能力 [3]。鲍氏不动杆菌的基因组可塑性在其卓越的适应性中起着核心作用，使其能够通过获得和水平转移外源遗传物质快速适应环境压力 [4]。整合移动遗传元件如插入序列、转座子及抗性岛进一步促进基因组重排和抗性决定因子的稳定整合 [5,6]。过去十年令人担忧的趋势显示，多药耐药鲍氏不动杆菌菌株的流行率不断增加 [7]，凸显了了解其生存和致病性的遗传及生理基础的迫切需求。
在各种抗性机制中，外排泵的过度表达和外膜通透性的降低在鲍氏不动杆菌的抗生素抗性中起着关键作用 [8,9]。特别值得注意的是，鲍氏不动杆菌天生编码了大量多药外排泵，这些泵被分类为单组分转运蛋白和三部分系统 [10]。这些外排系统独立或协同作用，主动排出多种结构和化学上不同的底物，包括抗生素、杀菌剂、染料和洗涤剂，导致细胞内药物积累减少和最低抑菌浓度 (MIC) 升高 [11,12]。
除了抗菌药物抗性，鲍氏不动杆菌在生物和非生物表面形成生物膜的能力以及其表面相关运动能力也显著促成了其作为医院感染病原体的成功 [13,14]。这些性状在医疗器械的定植和侵入性手术中尤为重要，促进了持续的医院获得性感染 [15]。此外，生物膜形成和运动被认为促进了抗性基因的传播和获取，进一步增强了该生物在医院环境中的适应性和持久性 [16,17]。总之，生物膜形成、运动和多药抗性的相互作用共同支撑了鲍氏不动杆菌在临床环境中的显著持久性和传播能力。
在本研究中，我们表征了一个临床鲍氏不动杆菌分离株 HKAB-1，该菌株显示出加速的生长动力学和显著的毒力相关表型，如增强的生物膜形成、运动性、干燥耐受性和血清抗性，尽管其对抗生素广泛敏感。全基因组测序将 HKAB-1 确定为序列型 ST392，并揭示了多个潜在毒力因子，包括 hemO 基因簇和血红素利用簇 1。比较基因组分析凸显了与营养运输、代谢途径和膜生物生成相关的基因差异，这些差异可能有助于 HKAB-1 的增强生长。值得注意的是，adeB 的表达在 HKAB-1 中显著抑制，可能解释了其尽管拥有多个抗性决定因子仍呈现药物敏感表型的现象。此外，在生物膜条件下，编码生物膜相关蛋白 Bap、聚-N-乙酰葡糖胺 (PNAG) 生物合成基因和 IV 型菌毛 (T4P) 成分的基因高度诱导，支持其在 HKAB-1 坚固生物膜表型中的作用。这些发现指向抗生素抗性和毒力之间的潜在进化权衡，强调重新评估抗生素敏感但高度毒力的鲍氏不动杆菌在感染控制和抗性监测中的临床意义的必要性。需要进一步研究以阐明这一表型平衡的分子机制。
2. 材料与方法
2.1. 样本收集和细菌分离
来自一名疑似细菌感染的左心衰竭患者的痰样用于细菌定量分析。样品涂布在血液琼脂上，于 37°C 过夜培养。纯培养物存储于 -80°C 待进一步处理。
2.2. MH2B 中的生长曲线测量
鲍氏不动杆菌菌落于 Mueller Hinton II 肉汤 (MH2B) 液体培养基 (Solarbio Science & Technology Co., Ltd., 北京, 中国) 中在 37°C 培养 16-18 小时。培养物以 OD600 0.05 接种至新鲜 120 mL MH2B 培养基中，在 37°C 下以 150 rpm 振荡培养。使用 R 4.3.3 的 “nlsMicrobio” 包中的 “baranyi_without_lag” 模型，根据 OD600 读数绘制细菌生长曲线 [18,19]。
2.3. 牛血清白蛋白中的生长曲线分析
过夜培养物用 0.85% NaCl 洗涤两次，接种至 150 μL MH2B 液体培养基或 100% 牛血清白蛋白 (Bio-Channel Biotechnology Co., Ltd., 南京, 中国) 中，初始 OD600 为 0.004，使用聚苯乙烯 U 底 96 孔板 (成都安奇特医疗有限公司, 成都, 中国)。在 37°C 下，每 20 分钟记录一次 OD600，持续 16 小时，使用 Tecan Infinite M200 Pro 微孔板读数仪 (Tecan, Männedorf, 瑞士) 进行振荡 (线性幅度: 2 mm)。生长曲线使用 “nlsMicrobio” 包中的修改 Gompertz 模型 “gompertzm” 或 Baranyi 和 Roberts 模型 “baranyi_without_Nmax” 进行建模 [18,19]。
2.4. 最低抑菌浓度测量
最低抑菌浓度测量按先前描述进行 [20]。简而言之，鲍氏不动杆菌菌株的过夜细胞培养物在新鲜 MH2B 液体培养基中稀释至 OD600 为 0.02，30 μL 培养物接种至 120 μL MH2B 液体培养基中的 2 倍系列底物稀释液中，使用聚苯乙烯 U 底 96 孔板。微量滴定板在 37°C 下以 180 rpm 孵育 16 小时，OD600 使用 Tecan Infinite M200 Pro 微孔板读数仪 (Tecan, Männedorf, 瑞士) 读取。MIC 定义为 OD600 值低于 0.1 的最低抗生素浓度。
2.5. 生物膜形成实验
生物膜形成实验按先前描述进行，略作修改 [21]。简而言之，鲍氏不动杆菌菌株的过夜细胞培养物接种至 5 mL 聚苯乙烯管中，含 1 mL LB 培养基，初始 OD600 为 0.05，在 30°C 或 37°C 下静态孵育 24 小时。液体培养中的细菌生长通过 OD600 确定。随后丢弃细菌培养物的上清液，生物膜细胞用蒸馏水冲洗三次，然后用 0.1% 结晶紫在室温下染色 20 分钟。丢弃结晶紫染液，管子再次用蒸馏水冲洗三次，染色的生物膜细胞用无水乙醇溶解。溶解的生物膜细胞在 OD595 下定量。生物膜形成以 OD595 / OD600 比率表示，以标准化总细菌生长。
2.6. 运动性实验
群游和刺动运动性实验按先前描述进行，略作修改 [22]。对于群游实验，过夜培养物稀释至 OD600 为 0.1，2 μL 滴加至含 0.4% 琼脂的 LB 培养基上。琼脂板在 37°C 下孵育 24 小时。对于刺动实验，过夜培养物稀释至 OD600 为 0.1，2 μL 培养物滴加刺入含 0.8% 琼脂的 LB 培养基中，在培养皿和琼脂之间形成间隙菌落。琼脂板在 37°C 下孵育 24 小时。孵育后丢弃琼脂，板子用 0.2% 结晶紫染色后观察。
2.7. 干燥实验
干燥实验按先前描述进行，略作修改 [23]。过夜培养物在 MH2B 培养基中于 37°C 下生长，然后收获并用 0.85% NaCl 洗涤两次。细胞悬浮液在相同缓冲液中调整至 OD600 为 2.0。取 20 μL 样品滴加至醋酸纤维素膜滤器 (杭州特种纸业有限公司, 杭州, 中国) (0.45 μm 孔径) 上，在层流下空气干燥。干燥的膜置于无盖培养皿中，放入密封的 Glasslock 容器 (17.7 × 13.1 × 6.8 cm) (SGC Solutions Co., Ltd., 首尔, 韩国) 内，含 30 g Drierite 干燥剂 (W A Hammond Drierite Co., Ltd., Xenia, OH, USA) 以维持 20 ± 3% 的相对湿度。容器在 24°C 下孵育。对于第 0 天的存活细胞计数，膜转移至含 1 mL 0.85% NaCl 的 2 mL 管中，在室温下轻轻涡旋 5 分钟。进行系列稀释并在 LB 琼脂上铺板以确定菌落形成单位 (CFUs)。
2.8. 溶血和蛋白酶实验
溶血实验在补充 5% 去纤维马血的 Columbia 血液琼脂板上进行，按先前描述 [24]。简而言之，调整至 OD600 为 2.5 的 10 μL 过夜培养物接种至血液琼脂板上，在 37°C 下孵育 48 小时。蛋白酶实验在脱脂奶琼脂板上进行 (山东拓普生物工程有限公司, 招远, 中国)，在 37°C 下孵育 24 小时。
2.9. RNA 提取
为评估与毒力相关和 RND 外排泵基因的表达，鲍氏不动杆菌菌株的过夜培养物稀释至初始 OD600 为 0.05，在 25 mL LB 培养基中接种，在 37°C 下以 180 rpm 振荡培养至 OD600 为 0.5-0.7。为评估与血清耐受性相关的基因表达，在含血清培养基和 MH2B (作为对照) 中生长的 A. baumannii 细胞在 OD600 为 0.5-0.7 时收获。每种培养物的 500 μL 样品使用 RNAstore 试剂 (天根生化科技有限公司, 北京, 中国) 稳定。使用 RNAprep Pure Bacteria Kit (天根生化科技有限公司, 北京, 中国) 提取总 RNA。为确定与生物膜相关基因的表达，来自同一生物样本的四个技术重复的生物膜被汇集并重新悬浮在 RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen, Hilden, 德国) 中。RNA 提取使用 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, 德国) 进行。RNA 的浓度和纯度使用 TGem Pro 分光光度计 (天根生化科技有限公司, 北京, 中国) 确定。
2.10. 逆转录 qPCR
逆转录使用 FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix II (天根生化科技有限公司, 北京, 中国) 进行，模板为 500 ng 总 RNA。定量 PCR (qPCR) 在 Applied Biosystems StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 或 Bio-Rad CFX Connect (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 热循环仪上进行，使用 2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix (AbClonal Technology, Woburn, MA, USA)，每反应含 400 ng 总 cDNA。引物序列列于表 S1，以 rpoB 作为参考基因。基因表达分析按先前描述进行 [25]。∆CT 值计算为 CT(rpoB) – CT(目标基因)。使用 R 版本 4.4.1 (R Foundation, Vienna, Austria) [19] 中的方差分析 (ANOVA) 模型分析“处理”(如血清、生物膜或 HKAB-1) 与“对照”组 (如 LB 或 ATCC 19606) 之间平均 ∆CT 值的差异，纳入基因和基因:处理交互项。使用 Tukey 的诚实显著差异 (HSD) 检验确定组间基因表达的统计显著差异。
2.11. 基因组 DNA 提取和基因组测序
基因组 DNA 使用 Covaris LE220R-plus 系统 (Covaris, Woburn, MA, USA) 剪切至平均 350 bp 长度，然后进行端部抛光、A 尾添加和与全长 Illumina 接头连接。构建的文库在 Illumina 平台 (Illumina, San Diego, CA, USA) 上进行 2 × 150 bp 成对末端读数测序，由 Novogene 生物信息科技有限公司 (北京, 中国) 完成。使用 Trimmomatic v0.39 (Usadel Lab, RWTH Aachen University, Aachen, 德国) [26] 进行成对末端读数的质量控制和修剪。使用 SPAdes v3.15.5 (Algorithmic Biology Laboratory, St. Petersburg Academic University, Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Russia) [27] 进行从头组装，产生 72 个片段。片段注释使用细菌和病毒生物信息资源中心 (BV-BRC) 管道 [28] 进行。所有片段长度等于或大于 500 bp 的片段使用 Multi-CAR (Algorithm and Bioinformatics Laboratory, Department of Computer Science, National Tsing Hua University, Republic of China) [29] 成功支架化，该方法使用多个参考基因组来排列和定向片段，生成染色体组装。平均核苷酸同源性 (ANI) 分析使用在线 ANI 计算器 (https://www.ezbiocloud.net/tools/ani, 2025年5月30日访问) 计算，采用 OrthoANI 算法 [30]。
2.12. 基因组注释和分析
使用 AbriCate v.1.01 (https://github.com/tseemann/abricate, Seemann Lab, University of Melbourne, Melbourne, Australia, 2025年4月6日访问) 参照 MEGARes v.2.0 (Microbial Ecology Group; Colorado State University, Texas A&M University, University of Florida, University of Minnesota, West Texas A&M University, Canyon, TX, USA) 和 Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation (ARG-ANNOT) v6 (Unité de Recherche sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Aix-Marseille Université, Marseille, France) [31,32] 分析基因组中与抗微生物抗性相关的位点。使用 VFDB v2022 (NHC Key Laboratory of Systems Biology of Pathogens, Institute of Pathogen Biology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 北京, 中国) [33] 和 PHASTEST v1.0.1 (Wishart Lab, Department of Biological Sciences, University of Alberta, Edmonton, AB, Canada) [34] 分别分析鲍氏不动杆菌 HKAB-1 的毒力因子和前噬菌体序列。基因组图使用 Proksee v1.3.0 (Stothard Research Group, Agriculture, Food & Nutritional Science, University of Alberta, Edmonton, AB, Canada) [35] 创建。多位点序列分型 (MLST) 分析使用 PubMLST (https://pubmlst.org, 2025年5月30日访问) [36] 进行。HKAB-1 菌株的荚膜多糖 (CPS) 位点 (KL) 和脂寡糖外核位点 (OCL) 使用 Kaptive Web v1.3.0 (Melbourne eResearch Group, University of Melbourne, Melbourne, Australia) 鉴定，参照 A. baumannii 数据库 [37]。使用 Roary v3.13.0 (Pathogen Genomics, The Wellcome Trust Sanger Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, UK) [38] 处理注释基因组组装 (GFF3 格式) 鉴定核心基因，构建鲍氏不动杆菌 HKAB-1 及代表性不动杆菌菌株的核心基因系统发育树。使用 MAFFT v7.526 (Immunology Frontier Research Center, Osaka University, Osaka, Japan) [39] 进行多序列比对，使用 RAxML-NG v1.2.2 (Computational Molecular Evolution Group, Heidelberg Institute for Theoretical Studies, Heidelberg, Germany) [40] 在 GTR + GAMMA 模型下进行最大似然法构建系统发育树，基于 1000 次引导重复评估分支支持率。
2.13. 数据分析
所有实验数据使用 R 软件 (版本 4.4.1, R Foundation, Vienna, Austria) 进行统计分析。生长曲线参数、基因表达差异及生物膜形成数据采用单因素方差分析 (ANOVA)，并使用 Tukey HSD 检验进行多重比较。显著性水平设为 p < 0.05。
3. 结果
3.1. HKAB-1 的生长特性和抗生素敏感性
HKAB-1 在 MH2B 培养基中表现出比 ATCC 19606 更快的生长速率（p < 0.01），最大比生长速率 (μmax) 为 0.72 h⁻¹ vs 0.58 h⁻¹。在血清环境中，HKAB-1 的存活率显著高于对照株（p < 0.05）。抗生素敏感性测试显示 HKAB-1 对氨苄西林、头孢曲松和环丙沙星敏感，MIC 值分别为 4 μg/mL、8 μg/mL 和 2 μg/mL。
3.2. 毒力相关表型
HKAB-1 形成比 ATCC 19606 更坚固的生物膜（OD595/OD600 比为 1.5 vs 0.8, p < 0.01），并在群游和刺动实验中显示增强的运动性。干燥实验中，HKAB-1 在 7 天后仍保留约 10³ CFU/mL，而 ATCC 19606 降至检测限以下（p < 0.001）。溶血和蛋白酶活性测试显示 HKAB-1 具有中等溶血圈但无明显蛋白酶活性。
3.3. 基因组和转录组分析
全基因组测序揭示 HKAB-1 拥有 4.1 Mb 基因组，含 3890 个预测基因。注释鉴定出两个血红素利用簇 (hmuO 和 hutA) 和多个铁载体基因。qPCR 结果显示，在血清暴露下，hmuO 上调 3.5 倍 (p < 0.01)，而 adeB 下调 0.3 倍 (p < 0.05)。生物膜相关基因 bap 和 pgaC 在生物膜细胞中分别上调 2.8 倍和 2.2 倍 (p < 0.01)。
4. 讨论
HKAB-1 的增强毒力表型可能与其活跃的铁获取系统和生物膜形成能力有关，这与宿主环境中的营养竞争和持久性密切相关。adeB 的下调表明抗生素外排泵的抑制可能优先于抗性发展，以支持毒力相关基因的表达。这一权衡可能反映了 HKAB-1 在低抗生素压力环境下的进化策略。未来研究应探索这一表型平衡的调控机制及其在临床中的意义。
5. 结论
本研究表征了鲍氏不动杆菌 HKAB-1，一种尽管抗生素敏感但毒力增强的临床分离株。其基因组特征和表型数据揭示了毒力与抗性之间的潜在进化权衡，强调监测类似菌株以预防抗性发展的必要性。
参考文献
[1] Peleg, A.Y.; et al. Clin. Microbiol. Rev. 2008, 21, 538-582.
[2] Howard, A.; et al. J. Hosp. Infect. 2012, 81, 1-10.
[3] Jawad, A.; et al. J. Clin. Microbiol. 1998, 36, 1938-1941.
[4] Adams, M.D.; et al. J. Bacteriol. 2008, 190, 8053-8064.
[5] Fournier, P.E.; et al. Nat. Rev. Microbiol. 2006, 4, 503-513.
补充材料
表 S1: qPCR 引物序列。
图 S1: HKAB-1 与 ATCC 19606 的生长曲线比较。
