模型选择与对比：如何在有限功效下回答“two≈one@17h、two>one@24h（尤其ΔadeIJ）”
三种模型的对比
1) 分层按时间做（Option A：每个时间点各跑一个模型）
公式：在 17 h 子集：~ exposure * genotype；在 24 h 子集：~ exposure * genotype
（因为同一子集里 time_h 不变，再加 + time_h 是冗余的）
能回答的问题
- 直接给出同一时间点内的所有核心对比（如 two vs one、基因型差异及其交互）。
- 很适合你现在关心的：“17 h 两次≈一次，而 24 h 两次>一次？”
优点
- 参数少、功效高（不去估计三方交互）。
- 结果直观：每个时间点一套 DEGs，便于和 Fig.3c 的现象逐一对应。
- 抗不平衡设计（两个时间点样本数/离群点不一样时更稳）。
缺点
- 不能在一个模型里“正式检验”时间是否改变了暴露×基因型的效应（缺少三方交互的整体显著性检验）。
- 跨时间比较需要你在结果层面去比对（例如比较 17 h 和 24 h 的 LFC/DEG 数），不是模型内参数。
适用场景：样本量有限、你最关心分时间的效应；先得到清晰、功效高的 per-time 结果。
2) 全局简化模型（Global reduced）：~ exposure * genotype + time_h
能回答的问题
- “暴露效应是否被基因型修改？”（有 exposure×genotype 交互）
- 同时控制了一个时间的平均主效应。
优点
- 比全模型参数更少、功效更高。
- 仍可做“差-中-差”式的交互检验（但这是跨两个时间的平均）。
缺点
- 假设暴露×基因型的交互在 17 h 和 24 h 相同/相似；
- 无法告诉你“17 h 小、24 h 大”（时间特异的交互被“平均”掉）。
适用场景：如果 PCA/探索性分析显示时间影响较小而且平行，且你只想得到“平均意义”上的交互结论。
3) 全模型（Full）：~ exposure * genotype * time_h
能回答的问题
- 所有主效应与全部交互，尤其是三方交互（检验“暴露×基因型 的差异是否随时间改变”）。
- 可用 LRT（似然比检验） 与简化模型比较，正式证明时间特异。
优点
- 统计上最完整；能一口气检验你提出的“17 h 小、24 h 大”这种时间依赖。
缺点
- 参数最多、功效最低（在基因层面更难达显著；多重比较负担更大）。
- 解释略复杂（系数多，需要合成对比）。
适用场景：样本量足/信号强，或者用于确证“时间改变交互”的结论（比如在 Option A 看到强烈趋势之后）。
给你这套数据的建议（结合你目标与当前信号）
主分析：优先用 Option A（分层按时间）
- 在 17 h 和 24 h 分别拟合
~ exposure * genotype，导出 two vs one（WT 与 ΔadeIJ 各一套）。 - 这和 Fig.3c 的读图是一致的，功效也最好；如果你的预期正确，17 h 的 two vs one 基本不显著，24 h 显著增多，尤其是 ΔadeIJ。
确证时间依赖（可选但推荐）：跑一版 全模型
- 用
~ exposure * genotype * time_h做 LRT 对比简化模型~ exposure * genotype + time_h，
若大量基因在 LRT 中显著 ⇒ 说明三方交互真实存在（时间改变了交互）。 - 对重点基因/通路，再报告三方交互的方向与效应量。
若功效更有限或只想给一个“总体交互”的结论：
- 可以只给 Global reduced 的结果（平均的 exposure×genotype 交互），
- 再辅以 Option A 的火山图作为“时间分层的可视化支持”。
简短决策树
- 你要看清 17 h vs 24 h 的差别 → Option A
- 你要在统计上证明“差别随时间改变” → Full + LRT（可在 Option A 之后做）
- 你要功效最大但只要平均结论 → Global reduced
实操小贴士
- 两个时间点样本数尽量均衡；有离群点先处理（PCA/库大小/样本间相关）。
- 需要时加入批次/库制备等协变量（
+ batch），在三种模型里都可以加。 - 报告时同时给：DEG 数、FDR、代表基因 LFC，并用 GSEA/富集做通路层面的对照。
- 图表：每个时间点出 two vs one 的火山图/热图；全模型的 LRT p 值分布或显著通路一览。
一句话结论
为了回答你现在最关心的“17 h 的 two≈one，24 h 的 two>one，尤其在 ΔadeIJ”，Option A 是首选（清晰、功效高）；随后用全模型 + LRT补一个“官方盖章”的时间依赖即可。
0. 术语速览（便于快速阅读）
- MDR：多重耐药（Multi-Drug Resistance）
- RND 外排泵：Resistance–Nodulation–Division 家族（A. baumannii 主要为 AdeABC/AdeIJK）
- sub-MIC / 亚MIC：低于最低抑菌浓度（MIC）的暴露/处理
- R/S 亚群：在选择压力下仍能成殖的耐受/适应亚群（R）与不成殖/受损的易感亚群（S）
- PAP：群体分析谱（Population Analysis Profiling）
- Time-kill / MDK：时间杀菌曲线 / 最小杀灭持续时间（MDK99/MDK99.99）
- AUM：人工尿培养基（Artificial Urine Medium）
- MH2B（MHB）：Mueller–Hinton Broth 第二配方
- EPI：外排泵抑制剂（Efflux Pump Inhibitor）
1. 研究背景与问题定位
1.1 临床与公共卫生动因
- MDR 革兰阴性菌威胁升级，A. baumannii 在 ICU/院感中占比高，治疗选择有限。
- 最后线药物（替加环素、碳青霉烯等）敏感率下滑，且地区波动大，提示环境/宿主体内因素的重要性。
- 亚MIC 暴露在临床（药代/组织渗透/生物膜）与环境（废水/污泥/水体）里普遍存在，能驱动适应、耐受、异质耐药等演化过程。
1.2 科学空白
- RND 外排泵被公认为 A. baumannii 耐药关键，但基因表达与表型耐药不总一致；
- 异质性（heteroresistance/耐受/持留）与宿主相关培养基（AUM/尿液）的影响在常规 AST 中难以显现；
- 缺少将亚MIC → 表型异质 → 宿主环境转录重编程串联起来的系统证据链。
2. 科学问题、核心假说与研究目标
2.1 科学问题（What）
1) 亚MIC 替加环素如何诱发/放大 A. baumannii 的表型异质性与耐受/适应亚群？
2) RND 外排泵（AdeABC/AdeIJK）在这一过程中扮演何种动力学与调控角色？
3) 尿液/AUM等宿主相关环境如何重编程转录网络、改变药敏表型与毒力？
2.2 核心假说（Why + How）
- H1：反复亚MIC 暴露通过应激响应/膜稳健性/代谢重分配，选择或诱导“在膜/外排应激下仍能成殖”的 R 亚群上升；RND 缺失株（ΔadeIJ）这一现象尤显著。
- H2：RND 泵不仅通过外排直接降低胞内药物，还通过变构/能量耦联影响膜稳健、代谢与应激路径，放大表型异质。
- H3：尿液/AUM汇聚多因素（渗透压、尿素、金属离子、碳源限制），系统性重编程外排泵与代谢网络，导致MIC 变化与毒力改变。
2.3 研究目标（Deliverables）
1) 建立亚MIC → R/S 亚群的定量框架（PAP、MDK、脉冲生存）并定位分子机制；
2) 解析 RND 在异质性与宿主环境适应中的作用；
3) 构建UTI 相关药敏解读范式与EPI 靶点清单。
3. 实验总体设计与样本体系
3.1 株系与处理
- 菌株：WT（野生型）与 ΔadeIJ（RND 缺失），必要时扩展至 ΔadeIJK。
- 处理与命名逻辑：
- No（未暴露）：WT_17/24、deltaIJ_17/24
- One exposure（一次亚MIC）：pre_WT_17/24、pre_deltaIJ_17/24
- Two exposures（两次亚MIC，0.5×MIC ×2）：0_5_WT_17/24、0_5_deltaIJ_17/24
- 时间点：17 h、24 h（或 8/16/24 h 批次采样）
- Rationale：“05”表示每次 0.5×MIC 的两次脉冲，强调sub-MIC 叠加效应。
3.2 培养基与应用场景
- LB（液体/平板）：生长曲线（液体）、总 CFU 与母板（平板）。
- MacConkey agar（胆盐+结晶紫）：膜/外排应激选择，用于显化 R/S 亚群、计算 CFU_Mac/CFU_LB。
- MH2B（液体）：标准药敏/动力学参照。
- AUM（液体）/Urine（液体）：模拟尿路体内环境，用于生长、MIC 与 RNA-seq。
4. 指标体系与统计学（统一口径）
4.1 关键指标定义
- R 比例（3c 指标）：
R% = CFU_Mac / CFU_LB × 100% - R/S 比值（可选报告）：
R/S = CFU_Mac / (CFU_LB − CFU_Mac) - PAP 尾部比例：
p_tail = ΣCFU(≥MIC) / CFU(无药) - AUC（PAP 曲线下面积）：衡量整体耐受度
- MDK99 / MDK99.99：达到 99%/99.99% 杀灭所需时间
- 脉冲生存率：
survival = CFU_pulse / CFU_start - RNA-seq：DEGs（|log2FC| 与 FDR），通路富集（KEGG/GO），主成分贡献（PC1/PC2）
4.2 统计检验与多重校正
- 组间比较：t 检验/曼–惠特尼；多组用 ANOVA/Kruskal–Wallis + FDR/Bonferroni。
- 比例/计数：二项置信区间、Fisher 精确检验、GLM(logit)。
- 时间–生存类：分段回归/非线性拟合；MDK 的置信区间或 bootstrap。
- RNA-seq：DESeq2（FDR < 0.05；|log2FC| 阈值预先注册）。
4.3 生物学重复与效应量
- 每组 ≥3 生物学重复；报告 效应量（Cohen’s d 或 Cliff’s delta）与 95% CI，避免只看 p 值。
5. SOP：核心实验流程（可直接贴进方法学）
5.1 并行铺板（LB vs MacConkey）与 R 比例
1) 标准化 OD/CFU 接种；
2) 在目标时点（8/16/24 h）取样，并行涂布到 LB agar 与 MacConkey agar；
3) 过夜培养计数 CFU_LB / CFU_Mac；
4) 计算 R% = CFU_Mac/CFU_LB，记录 ±95% CI；
5) 统计 No vs One vs Two、WT vs ΔadeIJ 的差异。
5.2 复制平板分离 S（易感）
1) 先在 LB 无药制备母板（100–300 个离散菌落）；
2) 用天鹅绒/膜 整体复制到 MacConkey（±药物板）；
3) 选择板不长/显著受损的坐标 = S 候选；
4) 回到 LB 母板对应坐标挑取 S，纯化 2–3 轮，建库；
5) 验证：MIC（不升/接近原始群体）、Time-kill（无长尾）、PAP 尾部低。
5.3 PAP（Population Analysis Profiling）
1) 配置药物阶梯：0、0.25×、0.5×、1×、2×MIC（可扩展）；
2) 等量涂布 → 计数 CFU；
3) 作图（log10 CFU vs 浓度），计算 AUC 与 p_tail；
4) 统计处理间差异与效应量。
5.4 Time-kill / MDK
1) 固定高浓度药（杀菌剂常 ≥10×MIC；四环素类可选联合或耐受表征方案）；
2) 0–24 h 分时取样计 CFU；
3) 拟合曲线、估 MDK99/MDK99.99；
4) MDK↑/长尾加重＝耐受增强。
5.5 脉冲生存（Pulse Survival）
1) 给予短时高浓度脉冲（10–20×MIC，30–60 min）；
2) 终止药效、复苏、计 CFU；
3) 生存比例比较处理差异。
5.6 RNA-seq（尿液/AUM/MH2B & 暴露对照）
- 管线：FastQC → HISAT2/STAR → featureCounts → DESeq2；
- 批次设计：WT/ΔadeIJ ×（尿液/AUM/MH2B）×（No/One/Two）× 时间点；
- 输出：PCA（PC1/PC2）、DEGs（FDR<0.05）、KEGG/GO 富集；重点关注 外排泵（adeA/B/C、adeI/J/K）、膜/代谢/应激通路。
6. 初步结果（与前述一致的“证据链”）
6.1 Fig.3 — 亚MIC 暴露 → 适应与 R 亚群上升
- 3a：流程示意（未画基质）。
- 3b（LB 液体）：Two > One > None 的生长恢复/存活。
- 3c（R%）：R% = CFU_Mac/CFU_LB；在 ΔadeIJ 中 Two > One > None（16–24 h 最显著；*p<0.005, p<0.01**），WT 变化小。
6.2 Fig.4 — 预暴露后 R/S 表型分化与药板验证
- LB vs MacConkey：R 能长，S 不能长/受损；WT 在两板均可生长。
- 药板（四环素、碳青霉烯、利福平、多黏菌素、万古霉素）：S 不可成殖，R 表现更耐受。
6.3 Fig.5 — 培养基效应（AUM/Urine/MH2B）
- 生长：MH2B 最快；Urine 适中；AUM 较慢。
- MIC 转变：AUM 中 四环素类 ↓~4×、碳青霉烯 ↓~8×（vs MH2B），提示介质效应。
6.4 Fig.6 — 尿液/AUM 的全转录重编程
- PCA：Urine 沿 PC1（~75%）聚类；AUM 与 MH2B 沿 PC2（~20%）分离。
- DEGs/通路：两者各自独特且部分重叠；脲酶上调；Urine 中 adeB 上调、AUM 中 adeA/adeB 下调；富集 氨基酸/碳代谢、TCA 等。
7. 质量控制（QC）与混杂控制
- 接种量与生长期：统一 OD600/CFU 与生长阶段，避免接种效应。
- 时间点：固定 8/16/24 h（或 17/24 h）窗口；保证重复一致。
- 平板并行：同一稀释度并行涂布 LB vs MacConkey；同批操作。
- 批次效应：RNA-seq 采用阻断设计/ComBat 校正；PCA 检查批次漂移。
- 药物效力：MIC 校准、现配现用、稳定性检查；AUM/尿液配方与 pH/渗透压监控。
- 统计注册：预注册阈值（FDR、|log2FC|、效应量），报告完整。
8. 风险点与备选方案（Mitigation）
- R/S 不显著：提高重复数；增加 MacConkey 胆盐/结晶紫梯度；延长/调整暴露方案。
- RNA-seq 变异大：加大样本量或聚焦关键时间点；加入 RT-qPCR 验证。
- WT 也出现明显 R 上升：进一步引入 ΔadeABC / ΔadeIJK 与互补株，拆解特异性。
- MIC 与耐受定义混淆：采用 “MIC（稳态）+ MDK（动力学）”双标准区分。
9. 项目管理：时间线与里程碑
| 时间 | 核心任务 | 可交付物 |
|---|---|---|
| 2026 Q1–Q2 | 生长曲线/MIC/PAP/并行铺板体系搭建 | QC 报告、首版 SOP、基线数据 |
| 2026 Q3 | 演化实验/Time-kill/MDK/脉冲生存 | AUC/MDK/生存率统计与图表 |
| 2026 Q4 | RNA-seq（尿液/AUM/MH2B）、WGS | PCA、DEGs、KEGG/GO、突变谱 |
| 2027 Q1 | 敲除株构建与表型/分子验证 | RT-qPCR/WB/银染/代谢物数据 |
| 2027 Q2 | 综合分析与模型建立 | 机制图、整合图谱（Fig. Model） |
| 2027 Q3–Q4 | 论文/会议/专利 | 3–4 篇论文草稿、会议摘要、EPI 靶点清单 |
10. 预期产出与学术/临床价值
- 机制贡献：完整链路——亚MIC 暴露 → RND/膜/代谢 → R/S 异质 → UTI 环境转录重编程 → 药敏变化。
- 工具与范式：R 比例/PAP/MDK/脉冲生存的统一报告范式；UTI 相关 AST 的培养基效应提示。
- 转化潜力：聚焦 TM 变构/能量耦联位点的 EPI 设计；提示在 UTI 情景下药物/联合方案的优化路径。
11. 附：可直接复用的图注（精炼版，供英文化）
- Fig. 3：Sub-MIC tigecycline exposures (0.5×MIC ×1/×2) promote adaptation in ΔadeIJ; LB growth (OD600) shows Two > One > None; MacConkey tolerance ratio R% = CFU_Mac/CFU_LB increases significantly at 16–24 h (*p<0.005, p<0.01**); WT shows minimal change.
- Fig. 4：Post-exposure ΔadeIJ splits into R (grows on MacConkey) and S (impaired); S fails on drug plates (TET/CARB/RIF/PMB/VAN).
- Fig. 5：MH2B fastest growth; urine moderate; AUM slower; MICs drop in AUM (TET ~4×, CARB ~8× vs MH2B).
- Fig. 6：Urine clusters on PC1 (~75%); AUM separates on PC2 (~20%); urease up; adeB up in urine, adeA/adeB down in AUM; AA/carbon/TCA enriched.