DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-025-09225-2

组织中蛋白质的表达和位置代表了健康和疾病的关键决定因素。尽管多重成像的最新进展扩展了空间上可访问的蛋白质数量¹–³，但生物层（即细胞结构、亚细胞域和信号活性）的整合仍具挑战性。这是由于抗体面板组成和图像分辨率的限制，它们共同限制了图像分析的范围。在这里，我们提出面向病理的多重化（PathoPlex），一个可扩展、质量控制且可解释的框架。它将亚细胞分辨率的高多重成像与软件包结合，用于提取和解释跨生物层的蛋白质共表达模式（簇）。PathoPlex 被优化用于在95个迭代成像周期中以80 nm/像素映射超过140种商业抗体，并提供务实的解决方案，以实现至少40个存档活检样本的同時处理。在概念验证实验中，我们识别上皮JUN活性作为免疫介导肾病的关键开关，从而证明簇可以捕获相关的病理特征。然后，PathoPlex 用于分析人类糖尿病肾病。该框架将患者水平的簇与器官功能障碍联系起来，并识别具有治疗潜力的疾病特征（即钙介导的管状应激）。最后，PathoPlex 用于揭示没有组织学肾病的2型糖尿病个体中的肾应激相关簇。此外，生成基于组织的读出以评估对葡萄糖共转运体SGLT2抑制剂的响应。总之，PathoPlex 为民主化多重成像和在复杂组织中建立整合图像分析工具铺平了道路，以支持下一代病理图谱的发展。

空间生物学技术

空间生物学技术最近获得了更多关注，因为它们在保留组织学背景的同时提供了转录组和蛋白质组表达的分子洞见¹。术语“多重成像”指的是将基于抗体的标记扩展超出传统限制（即每切片3–4个抗体）²,³。有多种商业系统可用，性能和成本各异。例如，基于质谱的方法⁴,⁵需要专用设备和抗体与金属的偶联，从而以高精度和可重复性实现细胞分辨率（250至1,000 nm/像素）的空间投影。或者，基于显微镜的方法⁶,⁷在经济上更易获得，并依赖于DNA偶联抗体面板的循环检测或使用固定集成宽场显微镜的直接免疫荧光。虽然此类方法实现了200–300 nm/像素的图像分辨率，但检测速度和信号放大之间存在权衡。使用质谱和显微镜方法的研究结果⁸,⁹与文献的全面综述¹⁰一致，报告的面板范围在30至60个抗体之间。这项工作为开发图像分析策略奠定了基础，这些策略通过细胞分割¹¹–¹⁴专注于细胞身份和状态的识别。

2018年，迭代间接免疫荧光成像（4i）¹⁵被引入作为多重成像和高级图像分析的开源工具。这些技术基于使用未修饰的商业抗体，通过化学洗脱和灵活光显微镜的简单步骤进行免疫荧光成像的循环轮次。4i最初在体外应用，使用41个抗体以165 nm/像素的分辨率，这通过像素级分析实现了细胞损伤的功能多层亚细胞特征的检测。据我们所知，只有一项研究在多细胞样本¹⁶中重现了原始4i协议，具有足够的的多重成像深度（21个成像周期用于54个标记）和图像分辨率（160 nm/像素）来执行基于像素的图像分析。然而，尽管这是可用最大和最复杂的数据集之一，从多重成像派生的输出主要用于重述器官发育期间已知的细胞事件。在这种背景下，我们假设多重成像方法定义与健康和疾病相关的基于组织的整合特征的潜力仍未被充分探索。

当前技术水平

一项讨论基于抗体的多重成像当前格局的研究¹⁰显示，方法之间的性能存在多样性。从所有不同标准中，我们提出两个标准来评估支持旨在整合多个生物层的图像分析工具的潜力（补充图1a）：标记数量（面板大小）和每像素图像分辨率。虽然面板大小直接影响可分析过程的范围，但图像分辨率及其带来的生物学洞见更难理解。为了说明图像分辨率的重要性，我们比较了基于质谱的方法（补充图1b）和基于显微镜的方法（补充图1c），用于使用细胞身份和DNA标记分析肾脏样本。这一比较突出了明显的分辨率不匹配，这明显影响了勾勒亚细胞结构（例如，细胞核甚至核仁）和相邻细胞边界（例如，肾内皮和上皮细胞）的能力。

在报告的多重方法¹⁰中，平均面板大小约为37个标记，平均分辨率为267 nm/像素。最常用的系统，如成像质谱细胞仪（IMC；40个标记，1,000 nm/像素）和共检测索引（CODEX；56个标记，250 nm/像素），提供了当前商业标准的可靠参考。因此，大多数基于抗体的空间蛋白质组学领域的研究基本上依赖于单细胞分割作为核心步骤，类似于空间转录组学¹⁷,¹⁸中使用的方法。即，分辨率和面板大小都没有为更整合的图像分析提供基础。此外，大多数具有高细胞密度器官（例如肾脏）的研究通常报告细胞身份和状态¹⁹,²⁰，但没有提供跨生物域的整合数据。

这些限制代表了下一代多重成像方法扩展面板大小超出当前限制的机会。而且，可以构建计算工具，通过加权和连接每个生物层的贡献来提取健康和疾病的标志（补充图2）。

迈向下一代多重成像

在这里，我们介绍PathoPlex，一个可扩展、质量控制和可解释的框架。它将亚细胞分辨率的高多重成像与开源软件包结合，以促进甲醛固定石蜡包埋（FFPE）样本的整合分析（图1a）。

简而言之，多重成像通过迭代周期进行，首先进行间接免疫荧光标记，然后通过荧光显微镜（例如宽场或共焦）进行图像采集，随后进行抗体洗脱（图1a，第1部分）。为了防止组织抬起，我们推荐使用聚-D-赖氨酸涂层玻璃表面用于小规模实验，或使用（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（APTES）用于大规模实验，因为APTES比聚-D-赖氨酸更有效地防止组织脱离（方法）。在本报告中，我们最大的实验包括95个成像周期，使用针对150种蛋白质的抗体和20个仅使用二级抗体的质量控制成像周期，总共170层。经过详细检查，我们包括142层（122种蛋白质和20种质量控制）用于分析，生成>6000亿可用像素。值得注意的是，组织在95个成像周期内保持稳定，没有损坏迹象，这表明这不是技术的极限。

为了适应这些数据集的规模并启用生物信息学分析的模块化组成和可扩展性，我们开发了一个用于空间蛋白质组学的高性能计算库（我们称之为spatiomic），它利用基于图形处理单元（GPU）的各种算法²¹,²²，集成常见数据格式²³，并作为Python包通过PyPi注册免费提供（图1a，第2部分）。spatiomic包包括多个注册算法，以对齐单个标记的图像用于联合分析。为了识别蛋白质共表达模式，spatiomic包括预处理图像、获取代表性子样本、使用自组织映射（SOM）减少维度、构建基于相似性的邻域图并执行图聚类²⁴的模块。可以在实验数据集的所有图像中一致地识别共表达模式并进行空间投影。由于这些共表达模式基于像素级聚类生成，从现在起，我们将其称为“簇”。

每个簇都有潜力代表一个生物过程，并需要进一步解释（图1b）。作为第一步，分析每个标记对簇的个别贡献，以定义每个簇代表的特定共表达模式。为此，系统评估了平均标准化强度（每个标记的贡献水平）和相对于其他簇平均值的log2转换折叠变化（每个标记的特定贡献）。由于每个标记代表具有已知或预测位置、分布和表达模式的蛋白质，它可以投影回空间进行视觉验证。簇丰度用作可量化指标，以统计比较条件并隔离差异表达的簇。值得注意的是，簇丰度的变化不仅可以源于蛋白质表达水平的差异，还可以源于蛋白质分布的变化（例如，从细胞质到核的转移）。

作为概述，我们首先在三个不同器官中提供了概念证明和质量控制数据集（<30个标记，160 nm/像素分辨率）。PathoPlex 然后使用肾脏作为高细胞密度和结构复杂性的模型器官，通过深入分析三个额外数据集进行验证（图1c）。这些数据集来自以下来源：（1）免疫介导肾病的实验小鼠模型（34个标记，80 nm/像素）；（2）诊断为晚期糖尿病肾病（DKD）的个体临床活检样本（61个标记，160 nm/像素）；以及（3）诊断为青年发作2型糖尿病（T2D）的个体研究活检样本（142个标记，80 nm/像素），没有DKD的病理迹象，包括短期使用SGLT2抑制剂治疗的个体子集。

概念证明和质量控制

概念证明实验基于自身免疫性肝炎、脑膜瘤和局灶节段性肾小球硬化（补充图3）的代表性样本，并在人类肝脏、脑和肾脏的对照中（补充图4），显示了在病理中的广泛适用性和标记选择的广泛潜力，包括转录因子、酶、结构蛋白质、亚细胞域、细胞表面受体和磷酸化靶点。

PathoPlex的质量控制标准首先在小鼠组织中建立，然后扩展到人类样本。简而言之，连续的抗体面板成像周期构成了第一级控制。这一步很重要，因为不完全洗脱可能导致与后续周期的交叉反应或前一周期的残余信号。第二级控制涉及洗脱后的直接成像，以确认缺乏荧光信号（扩展数据图1a）。第三级控制包括使用二级抗体而不事先孵育一级抗体的成像周期（仅二级周期）。这一步确保了残余可存活一级抗体的缺失，并生成可以包括在图像分析中的额外层（扩展数据图1b）。第四级控制涉及多个成像周期后的成功再染色（扩展数据图1c）。这一阶段用于确认表位被保存和抗体洗脱的有效性。此外，我们通过95个成像周期对人类组织样本应用实际质量控制步骤。这一策略使用仅二级周期显示了完全洗脱效率（扩展数据图1d 和补充图5 和6）以及60个周期后的有效再染色（扩展数据图1e 和补充图7）。

一旦所有成像周期完成，进行图像对齐以考虑各种周期中的潜在移位。众所周知，细胞核可以轻松染色，但常用标签要么不稳定（例如，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI)）要么昂贵（例如，DRAQ5）。为此，我们引入N-羟基琥珀酰亚胺酯 (NHS-E)，一种常用于超分辨率显微镜²⁵的泛蛋白标签。NHS-E 一致生成用于对齐的参考图像，并显示与核参考相当的高性能（补充图8）。此外，NHS-E 可用于分割包含组织的区域，以限制潜在非特异性结合区域的分析。与DAPI 或 DRAQ5 不同，后者需要每个成像周期不断再染色，NHS-E 只需在协议开始时应用一次，并保持稳定达95个周期。

实际考虑

PathoPlex 结合不同策略来优化性能并最小化潜在批次效应的引入，包括适应性显微镜、可访问和可定制的成像设置以及液体处理的低成本自动化（扩展数据图2a）。PathoPlex 可以使用任何倒置荧光显微镜系统实现，包括宽场、旋转盘和共焦，这在图像分辨率、扫描时间和文件大小方面提供了灵活性（扩展数据图2b）。

值得一提的是，经典病理协议和一些多重技术可能无意中引入批次效应，因为样本作为单个幻灯片处理。相比之下，PathoPlex 使用成像室，可以在单次运行中并行处理多个组织。每个成像室被组织为独立且自包含的实验，包括对照和实验样本（扩展数据图2c）。考虑到平均未修饰组织病理样本的大小，商业解决方案可用于同时处理2至24个完整样本（扩展数据图2d）。然而，随着孔数的增加，手动移液增加用户错误的可能性。虽然可以通过自动化缓解这一错误来源，但商业可用的液体处理系统通常昂贵且无法为更广泛的科学社区所访问。为此，PathoPlex 引入两种基于3D打印的实际策略来简化液体处理。第一种方法涉及使用3D打印框架创建大型统一单孔成像室（11 × 7.4 cm）（扩展数据图2e 和补充图9a），它可以容纳40个完整人类肾活检样本（大约100 mm² 大小），甚至更多较小活检样本（例如，根据大小推断，这相当于大约77个皮肤活检样本）。第二种策略涉及染色和洗脱周期的自动化。为实现这一目标，我们将3D打印机重新用作低成本液体处理系统，打印头控制液体的添加和移除（扩展数据图2f、补充图9b 和补充视频1）。这种方法产生了成功的染色和洗脱周期（扩展数据图2g），节省大约70%的动手时间，并最小化用户输入（补充图9c）。虽然以前报道了使用4i原则的多重成像的自动化解决方案²⁶，但我们的通用框架为用户提供了根据需求设计实验的灵活性，包括样本大小和图像分辨率。

实验疾病的概念证明

接下来，我们进行了概念证明实验，其中PathoPlex 用于分析一个特征明确的免疫介导肾病小鼠模型²⁷的病理生理。这些小鼠表现出从急性损伤到新月形肾小球肾炎 (CGN) 的清晰疾病进程。即，尿中蛋白丢失（蛋白尿）、随后在肾过滤单位（肾小球）中发展病理损伤（新月形）和肾功能逐渐丧失。总共使用34个标记，以80 nm/像素的分辨率在40个以单个肾小球为中心的感兴趣区域 (ROI) 中获取大约50亿像素（图2a）。抗体面板设计用于检测细胞身份、亚细胞隔室和信号通路活性（补充表1）。从总共33个生成的簇中，27个簇被生物学定义。

图2 | 识别上皮JUN活性作为免疫介导肾病的关键开关。 a，在免疫介导肾病小鼠模型中概念证明实验的示意图概述，在病理损伤形成前（急性损伤）和后（CGN）（n = 10只小鼠；ROI = 40）。NTS，肾毒血清；抗体面板细节见补充表1。b，颜色编码簇的时空分布。c，具有生物学意义的解释簇示例（C28、C21、C4 和 C7）。每个点代表一个ROI，作为独立观察（对照n = 11个ROI，急性损伤n = 11个ROI，CGN n = 18个ROI），红色条代表中位数和四分位间距。Mes，间质。d，识别C21（pJUN作为顶级贡献者）作为损伤形成前后关键调控病机制。e，C21时空分布图像（左）和管状上皮细胞和PECs中的细胞特异频率（右）。f，使用JNK抑制剂 (JNKi) 处理减少PDGF介导的小鼠PECs体外集体迁移。在“集体迁移”中，误差条代表上下限。数据来自四个生物重复。Veh，载体。g，在人类肾活检样本中确认不同损伤阶段PECs中的pJUN表达（n = 12名患者和n = 3名健康个体），这也与CD44共表达相关。h，在CGN大鼠模型中免疫介导肾病进展期间使用JNKi作为预防策略（NTS前）和治疗策略（NTS后7天）的示意图概述。i,j，蛋白尿（所有组n = 4只大鼠）和肾小球损伤（第0天n = 4只大鼠，其他所有组n = 6只大鼠；红色条代表中位数和四分位间距）显示JNKi的直接预防（i）和治疗（j）效果。k，使用CD44表达作为PECs激活的读出，我们确认了JNKi对PECs激活的效果（使用i和j中所有可用大鼠）。差异簇丰度分析使用双侧t检验。簇组成分析依赖于带有Holm–Šidák校正的双侧t检验。对于其他比较，根据比较数量使用双侧Mann–Whitney、Kruskal–Wallis with Dunn、方差分析 (ANOVA) with Dunnett T3 或 ANOVA with Holm–Šidák检验。*P < 0.0001, P < 0.001, *P < 0.01, P < 0.05 或不显著 (NS)。比例尺，50 µm (c,e,g,k)。a、f 和 h 中的图表使用BioRender 创建。

图1 | PathoPlex。 a，PathoPlex 代表病理组织中高多重成像的通用框架（左）和分析蛋白质共表达模式 (PCP) 或簇的Python库 (spatiomic)（右）的组合。b，生成簇的逐步解释。c，本研究所有实验数据集的总结。比例尺，50 μm。FC，折叠变化；p，像素。

图3

图3 | 在人类DKD中识别钙介导的管状应激作为病机制。 a，使用DKD个体临床活检样本的实验设计示意图。b，颜色编码簇的时空分布。c，具有生物学意义的解释簇示例。d，DKD中差异丰度簇的识别。e，C19（代谢管状损伤）的时空分布图像。f，使用CellPose的细胞分割和细胞水平元簇的定义。g，具有高C19丰度的细胞水平元簇 (MC16) 示例，与近端小管 (PTs) 中的代谢损伤相关。比例尺，50 μm。

（注意：原文文档中见下一页的标题；根据提供文本编译标题。）

附加图表和数据

• 对照和DKD的投影簇。
• 簇丰度和签名。
• 药物交互和蛋白贡献者。
• 统计分析（log2[FC]、平均强度等）。
• n = 18对照 (RCC)，n = 20 DKD（晚期）。

（注意：未包括剩余35页。）