一、背景假说与验证目标

• 采用单分子光学镊子+荧光，研究LT蛋白在DNA上的装配、熔解与RAD51/RPA70共定位。
• 工作假说：如果“拉伸力”是主要驱动力，则力阶跃应伴随显著光子状态转变，否则支持“多聚化主导”模型，与论文结论一致。

二、数据准备与时间对齐

1. 统一时间轴
   • 将 force(t), photons(t), HMM状态序列重采样到同一采样率（如100 Hz）
   • 校正曝光延迟及采样偏移，保证时间戳一致
2. 漂白校正
   • 光子信号做指数衰减或局部基线漂移校正
   • 剔除长段漂白区或作为协变量标注
3. 去噪与标准化
   • 适度滤波（如中位数或Savitzky–Golay）
   • 光子信号与力均应Z-score化，便于对比

三、HMM结果信号选取

• 并行追踪：
  • 校正后的连续光子信号 photons(t)
  • HMM输出的状态转移与后验概率（state(t)、P(switch at t)）

四、三层相关性分析流程

A. 全局时间序列相关性

• 互相关函数（CCF）
  • 计算 force(t) 与 photons(t)/state(t) 的互相关，扫 ±L 秒时滞
  • 用块置换/相位随机化检验显著性，获得p值和置信区间
• 事件触发平均（ETA）
  • 以每个 change_time_s 为触发点，窗口 [t0−W, t0+W] 内叠加平均光子/状态曲线
  • 判断ETA在0附近是否有系统响应、显著性超置信区间

B. 事件级判定“相关/不相关”

• 对每个 change_time_s = t_i:
  1. 设窗口 Δ（如2秒），判断窗口内是否有：
     • HMM状态跃迁且后验>0.9
     • 或光子信号显著突变（|Δphotons| > 3×局部噪声SD）
  2. 标注候选“相关”（Yes），记录证据
  3. 用随机对照/置换检验（假阳性率，Fisher/置换测试，q<0.05）确定最终Yes/No
  4. 可选：检查方向一致性（如force上升是否更常引起信号/状态上升），用logistic回归检验

C. 位置（x坐标）相关性（若有位置信息）

• 按位置bin计算每bin相关率、驻留时间、事件占空比
• 热点分析：检验特定位点相关率是否显著高于其他bin或随机

五、统计模型拓展（可选）

• 点过程/危险率模型（Cox/Poisson回归），自变量含force、Δforce、方向、时间、位置等
• 加入分子ID/实验天数作为随机效应，提升稳健性

六、生物学意义解读

1. 若观察到“强相关”：

• 说明外力促进DNA局部解链或状态切换，可能改变蛋白装配/停留稳定性
• 若力学区间与论文设定不同，则为新发现或说明实验几何有差异

2. 若观察到“不相关”：

• 支持“多聚化驱动”主模型：LT多聚化优先结合/侵入ssDNA，之后ATP驱动解旋
• 与论文结论一致：10pN张力下力–光子信号无必然联系

七、change_time_s事件判定操作清单

1. 设定窗口Δ（如2秒）和阈值（HMM后验>0.9, |Δphotons|>3σ）
2. 对每个t_i，查找HMM跃迁或光子突变，候选Yes/No、证据类型及最大后验
3. 对全体事件做置换检验，统计显著性
4. 可选：检验方向一致性

八、注意事项与易错点

• 必做光漂白校正
• 多重比较做FDR校正
• 时间序列强自相关优先用互相关+置换检验
• 同步偏移一次性估计修正
• Δ窗口做敏感性分析

九、建议的最终交付物

• 互相关分析图 (force vs photons/HMM-state)
• 事件触发平均（ETA）图，含置信区间
• change_time_s事件级表：is_correlated, evidence, p_value, lag
• 位置热点图（如有）
• 结论文字：是否支持“多聚化主导/与力弱相关”模型

十、论文引用要点（适用于报告撰写）

• 不依赖ATP水解即可熔解，RAD51/RPA70可共定位
• 多聚化而非解旋活性是关键驱动力
• 10pN张力与无张力均可见LT与RAD51共定位，张力不是必要条件
• 多聚化数量与熔解标志强度/速度成正比（三聚体慢、双六聚体快且稳）

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附：可运行脚本支持

如需自动化，可将上述判定规则写成Python/R脚本，读入 force.csv、photons.csv、HMM_state.csv，并一键输出相关性图表和事件判定表。