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简单总结
鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）因其抗生素耐药性而广为人知，是医疗环境中一个严重的威胁。本研究分析了一株临床分离株HKAB-1，尽管其对多种抗生素高度敏感，但表现出显著的毒力相关特性。与参考菌株ATCC19606相比，HKAB-1在血清和干燥条件下显示出更强的存活能力。HKAB-1还形成了强大的生物膜并表现出更高的运动性，这些表型与持久性和致病性相关。基因组和转录组分析表明，HKAB-1拥有活跃的铁获取和血红素利用系统，这些系统在宿主类似条件下高度响应。此外，我们发现与生物膜形成相关的基因在生物膜细胞中高度诱导。相反，adeB基因的表达显著降低，这可能解释了其尽管携带多种抗性基因仍对药物敏感的表型。这些发现反映了某些鲍曼不动杆菌菌株可能存在一种进化权衡，倾向于毒力相关特性而非抗菌抗性机制的表达。这一结果强调需要持续进行基因组监测，以追踪像HKAB-1这样高毒力但药物敏感的菌株的出现，这些菌株可能在选择压力下成为抗性发展的储备库。
摘要
鲍曼不动杆菌是一种以多重耐药性和环境持久性著称的机会性病原体。我们表征了一株临床分离株HKAB-1，尽管其对所有测试的抗生素高度敏感，但表现出显著的毒力相关特性。HKAB-1在MH2B、血清和干燥条件下显示出优越的生长能力，强大的生物膜形成能力，以及活跃的运动性。全基因组测序发现了两个血红素利用簇、多个铁载体生物合成途径以及其他毒力相关基因。基因表达分析显示，在血清暴露下，血红素利用和铁载体生物合成基因簇显著上调，表明铁获取途径在宿主类似条件下被激活。与生物膜形成相关的基因，包括bap、聚-N-乙酰葡糖胺（PNAG）生物合成基因和IV型菌毛（T4P）组分，在生物膜细胞中显著上调，支持其在增强生物膜表型中的作用。相反，编码主要RND外排泵的adeB基因显著下调，这可能解释了其药物敏感表型。比较基因组分析强调了与营养运输、代谢途径和膜生物合成相关的基因差异，这些差异可能支撑其增强的生长能力。这些发现指向抗生素抗性和毒力之间的潜在权衡，强调监测抗生素敏感但高毒力的鲍曼不动杆菌分离株的重要性，这些菌株可能作为抗性进化的潜在储备库。需要进一步研究以阐明这种表型平衡的机制。
关键词：鲍曼不动杆菌，血红素利用，毒力，血清抗性，干燥耐受性
鲍曼不动杆菌是临床环境中分离最常见的物种，已成为研究多重耐药性（MDR）的模型菌株[1 Vila 2007]。近年来，这种病原体对全球医疗系统构成了日益严重的威胁，引发多种严重的医院获得性感染，包括呼吸道、皮肤、尿路、伤口和血流感染[2 Dijkshoorn 2007]。该细菌在医疗环境中的持久性主要归因于其在恶劣条件（如干燥、消毒剂和长期抗菌药物暴露）下的卓越耐受能力[3 Fournier 2006a]。鲍曼不动杆菌的基因组可塑性在其非凡韧性中起着核心作用，使其能通过获取和水平转移外源遗传物质快速适应环境压力[4 Touchon 2014]。其整合插入序列、转座子和抗性岛等移动遗传元素的能力进一步促进了基因组重排和抗性决定因素的稳定整合[5 Fournier 2006b, 6 Peleg 2008]。过去十年的令人担忧的趋势显示，泛耐药性鲍曼不动杆菌菌株的流行率不断增加[7 Nowak 2017]，凸显了理解其存活和致病性的遗传和生理基础的迫切需要。
在众多抗性机制中，外排泵的过表达和外膜通透性降低在赋予鲍曼不动杆菌抗生素抗性中起着关键作用[8 Rumbo 2013, 9 Zgurskaya 2015]。特别值得注意的是，鲍曼不动杆菌固有地编码了大量多重耐药外排泵，可分为单组分转运体和三组分系统[10 Verma 2021]。这些外排系统单独或协同作用，可主动排出多种结构和化学性质不同的底物，包括抗生素、杀菌剂、染料和洗涤剂，从而导致细胞内药物积累减少和最低抑菌浓度（MIC）升高[11 Foong 2019, 12 Foong 2020]。
除了抗菌抗性外，鲍曼不动杆菌在生物和非生物表面形成生物膜的能力以及表面相关运动性也显著促进了其作为医院病原体的成功[13 Skiebe 2012, 14 Orsinger-Jacobsen 2013]。这些特性在医疗设备和侵入性操作的定植中尤为重要，有助于持久的医院获得性感染[15 Rodríguez-Baño 2008]。此外，生物膜形成和运动性被认为促进抗性基因的传播和获取，进一步增强了该菌在医院环境中的适应性和持久性[16 Wilharm 2013, 17 Penesyan 2019]。总体而言，生物膜形成、运动性和多重耐药性的相互作用支撑了鲍曼不动杆菌在临床环境中持续存在和传播的卓越能力。
在本研究中，我们表征了一株临床分离的鲍曼不动杆菌菌株HKAB-1，该菌株显示出加速的生长动力学和显著的毒力相关表型，如增强的生物膜形成、运动性、干燥耐受性和血清抗性，尽管其对多种抗生素广泛敏感。全基因组测序表明HKAB-1属于序列类型ST392，并揭示了多种潜在毒力因子的存在，包括hemO基因簇和血红素利用簇1。比较基因组分析显示，涉及营养运输、代谢途径和膜生物合成的基因差异可能导致HKAB-1的生长增强。值得注意的是，HKAB-1中adeB的表达显著受抑，这可能解释了其尽管携带多种抗性决定因素仍表现为药物敏感的表型。此外，在生物膜条件下，编码生物膜相关蛋白Bap、聚-N-乙酰葡糖胺（PNAG）生物合成基因和IV型菌毛（T4P）组分的基因被高度诱导，支持它们在HKAB-1强大生物膜表型中的作用。这些发现表明抗生素抗性和毒力之间可能存在进化权衡，强调需要重新评估抗生素敏感的鲍曼不动杆菌在感染控制和抗性监测中的临床意义。需要进一步研究以阐明这种表型平衡的分子机制。
样本收集和细菌分离
从一名疑似细菌感染的左侧心力衰竭患者收集的痰液样本用于细菌计数分析。样本被涂布在血琼脂平板上，并在37℃过夜培养。纯培养物被储存在-80℃以待进一步处理。
MHIIB生长曲线测定
鲍曼不动杆菌菌落在Mueller-Hinton II Broth（MH2B）液体培养基中于37℃培养16-18小时。培养物被接种到120毫升新鲜MH2B培养基中，初始OD600为0.05，并在37℃、150 rpm振荡培养。使用R 4.3.3中的“nlsMicrobio”包通过“baranyi_without_lag”模型绘制细菌生长曲线[18 Baty and Delignette-Muller 2014, 19 R Core Team 2021]。
牛血清白蛋白生长曲线分析
过夜培养物用0.85% NaCl洗涤两次，并接种到150微升MHIIB或100%牛血清白蛋白中，置于聚苯乙烯U形底96孔板中，初始OD600为0.004。使用Tecan Infinite 200 Pro微孔板读数仪（瑞士Tecan）在37℃每20分钟记录一次OD600，持续16小时。生长曲线使用R 4.3.3中的“nlsMicrobio”包通过改良Gompertz模型“gompertzm”或Baranyi和Roberts模型“baranyi_without_Nmax”进行建模[18 Baty and Delignette-Muller 2014, 19 R Core Team 2021]。
最低抑菌浓度测定
最低抑菌浓度（MIC）测定按之前描述的方法进行[20 Tam 2020]。简而言之，鲍曼不动杆菌菌株的过夜培养物被稀释至OD600为0.02，30微升培养物被接种到含120微升2倍系列稀释底物的MH2B液体培养基中，置于聚苯乙烯U形底96孔板中。微孔板在37℃、180 rpm孵育16小时，使用Tecan Infinite M200 Pro微孔板读数仪（瑞士Tecan）测定OD600。MIC定义为OD600值低于0.1的最低抗生素浓度。
生物膜形成实验
生物膜形成实验按之前描述的方法稍作修改后进行[21 Haney 2018]。简而言之，鲍曼不动杆菌菌株的过夜培养物被接种到含1毫升LB培养基的5毫升聚苯乙烯管中，初始OD600为0.05，并在30℃或37℃静置培养24小时。液体培养物的细菌生长通过OD600测定。随后，细菌培养物的上清液被丢弃，生物膜细胞用蒸馏水冲洗三次，然后用0.1%结晶紫在室温下染色20分钟。结晶紫染色液被丢弃，管子再次用蒸馏水冲洗三次，染色的生物膜细胞用无水乙醇溶解。溶解的生物膜细胞在OD595处量化。生物膜形成以OD595/OD600比率表示，以标准化总细菌生长量。
运动性实验
群集运动和抽搐运动实验按之前描述的方法稍作修改后进行[22 Clemmer 2011]。对于群集运动实验，过夜培养物被稀释至OD600为0.1，2微升培养物滴加到含0.4%琼脂的LB培养基上。琼脂平板在37℃孵育24小时。对于抽搐运动实验，过夜培养物被稀释至OD600为0.1，2微升培养物刺入含0.8%琼脂的LB培养基中，在培养皿和琼脂之间形成间隙菌落。琼脂平板在37℃孵育24小时。孵育后，琼脂被丢弃，培养皿用0.2%结晶紫染色后进行观察。
干燥耐受实验
干燥耐受实验按之前描述的方法稍作修改后进行[23 Oda 2022]。过夜培养物在MHIIB培养基中于37℃培养，然后收获并用0.85% NaCl洗涤两次。细胞悬液调整至OD600为2.0，20微升等分试样被移至醋酸纤维素膜过滤器（孔径0.45微米）上，并在层流下风干。干燥的膜被放置在未盖盖的培养皿中，置于含30克Drierite干燥剂的密封Glasslock容器（17.7 × 13.1 × 6.8厘米）内，以维持20±3%的相对湿度。容器在24℃孵育。第0天的活菌计数通过将膜转移到含1毫升0.85% NaCl的2毫升管中，室温下轻柔涡旋5分钟后进行。系列稀释液涂布在LB琼脂上以测定菌落形成单位（CFUs）。
溶血和蛋白酶实验
溶血实验在补充5%去纤维蛋白马血的哥伦比亚血琼脂平板上进行，如之前描述[24 Tuttobene 2021]。简而言之，调整至OD600为2.5的10微升过夜培养物被接种到血琼脂平板上，并在37℃孵育48小时。蛋白酶实验在脱脂乳琼脂平板上进行，平板在37℃孵育24小时。
RNA提取
为评估毒力相关和RND外排泵基因的表达，鲍曼不动杆菌菌株的过夜培养物被稀释至初始OD600为0.05，置于25毫升LB培养基中，于37℃、180 rpm振荡培养至OD600达0.5–0.7。为评估与血清耐受性相关的基因表达，在含血清培养基和MH2B（作为对照）中生长的鲍曼不动杆菌细胞于OD600达0.5–0.7时收获。每种培养物取500微升，使用RNAstore试剂（天根生物，中国）稳定。总RNA使用RNAprep Pure Bacteria Kit（天根生物，中国）提取。为测定生物膜相关基因的表达，生物膜使用RNAprotect Bacteria Reagent（Qiagen，德国）重悬浮。RNA提取使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，德国）进行。RNA浓度和纯度使用Nanodrop分光光度计测定。
反转录qPCR
反转录使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix II（天根生物，中国）进行，以500纳克总RNA为模板。定量PCR（qPCR）在Applied Biosystems StepOnePlus（美国Applied Biosystems）或Bio-Rad CFX Connect（美国Bio-Rad Laboratories）热循环仪上使用2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix（AbClonal Technology，美国）进行，每反应使用400纳克总cDNA。引物序列列于表S1，以rpoB作为参考基因。基因表达分析按之前描述的方法进行[25 Foong 2025]。ΔCT值计算为CT(rpoB) – CT(目标基因)。处理组（如血清、生物膜或HKAB-1）与对照组（如LB或ATCC19606）之间的平均ΔCT值差异使用R 4.4.1版实现的方差分析（ANOVA）模型进行分析，包含基因和基因:处理交互项[19 R Core Team 2021]。Tukey的诚实显著差异（HSD）检验用于确定组间基因表达的统计显著差异。
基因组DNA提取和基因组测序
基因组DNA使用标准苯酚-氯仿方法提取。基因组DNA使用Covaris LE220R-plus系统（美国Covaris）碎裂至平均350 bp。使用Rapid Plus DNA Lib Prep kit（AbClonal Technology，美国）制备DNA文库，并在Illumina平台上由诺禾致源生物信息科技有限公司（中国北京）进行2×150 bp双端读长测序。使用Trimmomatic v0.39进行质量控制和修剪[26 Bolger 2014]。使用SPAdes v3.15.5进行从头组装，得到72个contigs[27 Bankevich 2012]。contig注释使用细菌和病毒生物信息资源中心（BV-BRC）流程[28 Olson 2023]。所有长度≥500 bp的contigs使用Multi-CAR成功搭建脚手架[29 Chen 2016]，该方法使用多个参考基因组排列和定位contigs，形成染色体组装。平均核苷酸同一性（ANI）分析使用在线ANI计算器（https://www.ezbiocloud.net/tools/ani）通过OrthoANI算法进行[30 Yoon 2017]。
基因组注释和分析
使用Abricate v0.3（https://github.com/tseemann/abricate）分析与抗菌抗性相关的基因位点，参考MEGARes 2.0和抗生素抗性基因注释（ARG-ANNOT）数据库[31 Gupta 2014, 32 Bonin 2023]。使用VFDB[33 Chen 2005]和PHASTEST v1.0.1[34 Wishart 2023]分别分析HKAB-1的毒力因子和噬菌体序列。基因组图谱使用Proksee生成[35 Grant 2023]。多位点序列分型（MLST）分析使用PubMLST进行[36 Jolley 2018]。使用Kaptive Web v1.3.0结合鲍曼不动杆菌数据库鉴定HKAB-1菌株的荚膜多糖（KL）和脂寡糖外核（OCL）位点[37 Cahill 2022]。核心基因组系统发育树使用Roary v3.13.0处理注释基因组组装（GFF3格式）以识别核心基因[38 Page 2015]。使用MAFFT v7.526进行多序列比对[39 Katoh 2013]，并使用RAxML-NG v1.2.2在GTR+G模型下进行系统发育推断，包含1000次bootstrap重复[40 Kozlov 2019]。
菌株收集和鉴定
一名患有左侧心力衰竭并伴有细菌性呼吸道感染临床症状的患者入院。从患者痰液中分离出细菌分离株，命名为HKAB-1，在补充5%去纤维蛋白马血的哥伦比亚血琼脂平板上培养后获得。琼脂平板上未观察到溶血或蛋白水解活性（图S1）。根据初步表型特征，该分离株被初步鉴定为鲍曼不动杆菌。患者具有多种高危因素，包括高龄、严重心功能障碍和多器官功能障碍。根据医院治疗方案，启动了为期七天的哌拉西林-他唑巴坦作为经验性抗菌治疗。完成抗生素疗程后，患者的呼吸道症状显著改善。住院第九天，心脏检查显示心音正常，所有瓣膜区域无病理性杂音，肺部听诊发现双肺少量干啰音。鉴于临床改善，患者被认为适合出院。该分离株随后被转至中国南方大学衡阳医学院医学微生物学系进行分子鉴定和表型表征。
HKAB-1对多种抗生素更敏感
近年来，鲍曼不动杆菌相关感染因其多重耐药表型成为临床关注的重点[1 Vila 2007]。因此，我们评估了临床分离株HKAB-1相对于实验室菌株ATCC19606的抗生素敏感性特征，以明确菌株特异性抗性模式。出乎意料的是，HKAB-1对大多数测试抗生素显示出更高的敏感性，相比ATCC19606，仅对奥沙西林（2倍差异，MIC：512 μg/mL）和利福平（2倍差异，MIC：4 μg/mL）例外（表1）。值得注意的是，HKAB-1对阿米卡星、阿奇霉素、环丙沙星、多尼培南、四环素类和托布霉素的MIC降低了4-8倍，对阿莫西林和替加环素的MIC降低了高达16倍（表1）。
HKAB-1表现出增强的生物膜形成和血清抗性
鲍曼不动杆菌在临床环境中的持久性主要归因于其形成生物膜的能力，这是感染中的关键毒力因子[41 Lee 2008, 42 Espinal 2012]。为研究这些特性，我们评估了HKAB-1菌株的生物膜形成和血清抗性能力。为确保生物膜实验的准确标准化，我们首先分析了临床分离株HKAB-1和实验室菌株ATCC19606在MHIIB培养基中的生长动力学。HKAB-1菌株在MHIIB中的生长速率高于ATCC19606，最大特定生长速率（μmax）分别为0.87 ± 0.03 h⁻¹和0.63 ± 0.02 h⁻¹（非配对Student’s t检验，p < 0.005）（图1A-B）。一致地，5小时时间点的OD600测量值对HKAB-1也较高，ATCC19606的平均OD600值为1.57 ± 0.07，HKAB-1为1.91 ± 0.07（非配对Student’s t检验，p < 0.05）（图1C）。
鉴于生长动力学的显著差异，使用结晶紫染色量化的生物膜以相应静置孵育的浮游培养物的OD600进行标准化，以确保可比性和准确性。值得注意的是，HKAB-1在37℃比30℃形成略多的生物膜，尽管差异无统计学意义（非配对Student’s t检验，p = 0.11），而ATCC19606在生物膜形成中未显示温度依赖性变化（图1D）。有趣的是，HKAB-1在30℃下比ATCC19606显示出显著更强的生物膜形成能力（非配对Student’s t检验，Welch校正，p < 0.05），而在37℃下两菌株之间无显著差异（图1D）。
已知临床不动杆菌属具有高血清抗性[43 Magda 2022]。为评估HKAB-1菌株在牛血清白蛋白（BSA）中的存活能力，我们在聚苯乙烯U形底96孔板中监测了两种鲍曼不动杆菌菌株在BSA和MHIIB中的生长。如预期，HKAB-1在MHIIB中显示出比ATCC19606更强的生长（图1A, 1E），16小时时间点的平均OD600值分别为1.03 ± 0.01（HKAB-1）和0.85 ± 0.01（ATCC19606）（非配对Student’s t检验，p < 0.005）（图1F）。令人注目的是，HKAB-1在100% BSA中也显示出强劲的生长，而ATCC19606对BSA高度敏感，平均OD600值分别为0.57 ± 0.01和0.19 ± 0.02（非配对Student’s t检验，p < 0.005）（图1E, 1G）。这些发现凸显了HKAB-1在营养丰富和血清基础条件下的增强适应性（图1）。
HKAB-1表现出增强的运动性
表面相关运动性被认为是临床鲍曼不动杆菌分离株的常见特性[13 Skiebe 2012]。为评估临床分离株HKAB-1的运动性，我们在半固体琼脂上测定了HKAB-1和ATCC19606的群集运动和抽搐运动。孵育24小时后，HKAB-1在琼脂表面显示出显著更大的群集运动性，在琼脂-塑料界面显示出更大的抽搐运动性，平均直径分别为2.8 ± 0.1厘米和2.1 ± 0.1厘米（非配对Student’s t检验，p < 0.005）（图2A-D）。与之前研究一致[44 Eijkelkamp 2011]，ATCC19606在半固体培养基上无运动性（图2A-D）。
HKAB-1耐受干燥
之前研究表明，生物膜形成显著增强鲍曼不动杆菌的干燥耐受性，尽管可能以降低抗生素抗性为代价[45 Greene 2016]。我们假设HKAB-1菌株的高抗生素敏感性和增强的生物膜形成能力可能赋予其对长期干燥的更好耐受性。与此假设一致，干燥导致HKAB-1活菌数量相比初始接种量减少66.3%（Tukey的HSD检验，p < 0.005），而ATCC19606的存活率在仅一天孵育后几乎降至不可检测水平（图2E）。值得注意的是，干燥四天后，HKAB-1保留了约15.4%的存活率（Tukey的HSD检验，p < 0.005）（图2E），突显了其增强的干燥抗性。
HKAB-1菌株的基因组背景
为解释临床分离株与ATCC19606菌株在抗生素敏感性上的差异，我们对HKAB-1进行了全基因组测序，平均核苷酸同一性（ANI）分析[30 Yoon 2017]表明该分离株与鲍曼不动杆菌（NCBI accession CP059040）共享97.88%的同一性，确认了物种水平分类。组装的基因组总长度为3,758,367 bp，包含单一圆形染色体（图3A）。通过结合公开的不动杆菌基因组进行核心基因组分析，进一步验证了物种身份和系统发育关系。HKAB-1确实聚类在鲍曼不动杆菌分支内，显示出与临床相关菌株如AB030的密切进化关系（图3B）。值得注意的是，未检测到可检测的质粒。总体G+C含量为38.92%。基因组注释预测了3,559个基因，包括3,488个编码序列（CDSs）和71个RNA基因，包括4个rRNA和63个tRNA（表2）。在3,488个预测的CDS中，3,446个蛋白质编码基因根据COG数据库被分配到21个功能类别。此外，相当数量的基因被归类为未知功能（19.47%），表明需要进一步分析以阐明其功能。在硅MLST分析表明HKAB-1属于序列类型ST392（表S2），根据Pasteur方案[46 Diancourt 2010]。值得注意的是，ST392此前仅在2010年台湾的一个单一分离株中报道过，这引发了对其地理分布和潜在出现的疑问。
抗菌抗性基因的比较分析
使用Abricate（https://github.com/tseemann/abricate）进行抗菌抗性基因分析，参考MEGARes 2.0和抗生素抗性基因注释（ARG-ANNOT）[31 Gupta 2014, 32 Bonin 2023]，在HKAB-1和ATCC19606菌株中分别鉴定了27和28个可能与抗性基因相关的开放阅读框（ORFs）（表3）。在27个抗性基因中，21个与外排泵相关，包括10个来自抗性-分裂-细胞分裂（RND）家族的ORF，4个编码假定主要易化体超家族（MFS）家族的ORF，2个来自多重耐药和毒性外排（MATE）家族的ORF，1个来自小分子多重耐药（SMR）家族的ORF，以及5个编码假定转录调控因子的ORF。其余6个ORF与抗生素失活相关，包括5个β-内酰胺酶编码基因和1个编码氨基糖苷核苷酰转移酶（ant(3'')-IIa）的基因。与ATCC19606类似，HKAB-1基因组中缺乏编码外膜蛋白adeC的基因。鲍曼不动杆菌基因组中adeAB位点缺乏adeC是前所未有的，因为AdeAB可以招募另一个外膜蛋白AdeK形成功能性三组分复合物[47 Sugawara 2014]。有趣的是，HKAB-1携带的抗菌抗性基因数量与ATCC19606相当，但对所有测试抗生素显示出更高的敏感性。
毒力因子相关基因的比较分析
由于HKAB-1菌株表现出比ATCC19606更高的毒力，如生物膜形成、运动性和血清抗性，我们评估了两菌株之间不同毒力特性的遗传背景。HKAB-1基因组编码106个与毒力因子相关的ORF，分为七个主要功能家族，包括粘附、生物膜形成、磷脂酶、免疫逃避、铁摄取、调控功能和血清抗性（表S3）。相比之下，ATCC19606基因组包含95个毒力相关ORF，缺乏关键血红素利用基因，包括hemO基因簇（ACP71R_11060–ACP71R_11105）和血红素利用簇1（ACP71R_06965–ACP71R_07025），这些基因均存在于HKAB-1中（表S3）。此外，基因组还包含两个与PHAGE_Acinet_Bphi_B1251_NC_019541高序列相似性的假定噬菌体区域（图3A）。第一个噬菌体是一个完整的噬菌体，跨度43.7 Kb（位置2,159,893至2,203,690 bp），GC含量为38.67%。第二个噬菌体是一个不完整的噬菌体，长度30.9 Kb，位于1,930,574至1,961,551 bp之间，GC含量为35.65%。
除了通过VFDB鉴定的毒力因子外，荚膜多糖（KL）位点被认为是鲍曼不动杆菌致病性的关键决定因素[48 Russo 2010]。HKAB-1菌株携带KL107位点，位于编码假定FKBP型肽基-脯氨酰顺反异构酶（fkpA）的ACP71R_14980和lldP基因之间，以及OCL3位点，位于编码假定蛋白的ACP71R_00345和编码假定支链氨基酸转氨酶（ilvE）的ACP71R_00295基因之间。这些位点分别负责荚膜多糖（CPS）和脂寡糖（OCL）的生物合成和输出。值得注意的是，HKAB-1菌株的OCL3与通常位于ilvE和aspS之间的更常见OCL配置不同[49 Wyres 2020]。
外排泵和毒力相关基因的相对表达
为研究外排泵和毒力相关基因在抗生素抗性和致病性中的功能相关性，我们在相关表型条件下使用RT-qPCR量化了这些基因的表达水平。在LB培养基中，HKAB-1（adeG: ∆CT = -9.45 ± 0.15; adeJ: ∆CT = -1.97 ± 0.15）和ATCC19606（adeG: ∆CT = -9.42 ± 0.15; adeJ: ∆CT = -1.49 ± 0.15）之间adeG和adeJ的转录无显著差异（图4A）。相反，HKAB-1中adeB显著下调（ΔΔCT = -7.27 ± 0.21; 折叠变化 = 0.0065），可能导致其尽管携带多种抗性基因仍表现为抗生素敏感表型。
鉴于生物膜相关蛋白Bap、Csu菌毛、PNAG生物合成和IV型菌毛（T4P）在生物膜形成和抽搐运动性中的作用（表S2）[50 Loehfelm 2008, 51 Tomaras 2003, 52 Choi 2009, 53 Ronish 2019]，我们检查了HKAB-1中这些基因的转录特征。ATCC19606除csuC外，表现出相对较低的表达（bap: ∆CT = -4.95 ± 0.32; csuC: ∆CT = -1.22 ± 0.32; pgaB: ∆CT = -7.58 ± 0.32; pilA: ∆CT = -10.04 ± 0.32; pilO: ∆CT = -8.17 ± 0.32）（图4B）。编码Csu菌毛组装伴侣蛋白的csuC和编码PNAG生物合成脱乙酰酶的pgaB在两株菌之间无显著转录差异。然而，HKAB-1中bap和T4P特异性基因（包括编码假定菌毛蛋白的pilA和编码T4P生物合成蛋白的pilO）显著上调（bap: ΔΔCT = 3.03 ± 0.45; 折叠变化 = 8.14; pilA: ΔΔCT = 5.54 ± 0.45; 折叠变化 = 46.54; pilO: ΔΔCT = 2.42 ± 0.45; 折叠变化 = 5.34）（图4B），与其强大的生物膜和运动性表型一致。
为进一步评估生物膜相关基因在生物膜发育中的功能作用，我们比较了生物膜相关细胞和浮游培养物之间的表达。一致于我们早先的结果（图4B），csuC在两种条件下无显著转录差异（图4C）。出乎意料的是，在浮游细胞中表达水平较低的pgaB在生物膜细胞中强烈诱导（ΔΔCT = 5.55 ± 0.43; 折叠变化 = 46.79），支持PNAG生物合成在生物膜形成中的关键作用（图4C）。正如预期，bap和T4P特异性基因（pilA和pilO）在生物膜相关细胞中相对于浮游细胞进一步上调（bap: ΔΔCT = 2.06 ± 0.43; 折叠变化 = 4.17; pilA: ΔΔCT = 2.73 ± 0.43; 折叠变化 = 6.62; pilO: ΔΔCT = 3.77 ± 0.43; 折叠变化 = 13.60）（图4B, 4C）。有趣的是，在浮游HKAB-1中表达水平较低的RND外排泵基因adeB和adeG在生物膜相关细胞中显著诱导（adeB: ΔΔCT = 7.88 ± 0.43; 折叠变化 = 236.19; adeG: ΔΔCT = 7.54 ± 0.43; 折叠变化 = 185.98），而adeJ表达未变（图4C）。鉴于先前报道将铁载体生物合成与生物膜发育联系起来[54 Wang, 2025]，我们还检查了铁载体相关基因，发现basA（acinetobactin簇）和bfnL（fimsbactin簇）在生物膜细胞中强烈诱导（图4C），表明其在生物膜发育中的贡献作用。总的来说，HKAB-1相对于ATCC19606中bap和T4P基因的显著上调，结合其在生物膜条件下的进一步诱导以及PNAG、RND外排泵和铁载体系统的同步激活，提示了一个驱动HKAB-1强大生物膜表型的协同因子网络。
血红素利用簇在血清条件下对细菌存活至关重要[55 de Léséleuc 2014]。鉴于HKAB-1携带血红素利用基因，而ATCC19606缺乏这些基因，我们通过分析涉及血红素摄取和铁载体生物合成的基因表达，评估了铁获取系统对血清暴露的调控反应。在MH2B标准生长条件下，血红素获取基因（包括编码假定血红素氧化酶的hemO和血红素利用簇1中预测的TonB依赖性受体的ACP71R_07005）以及铁载体生物合成基因（如basA和bfnL）的表达相对较低（图4D，x轴）。在血清暴露下，所有四个基因显著激活（hemO: ∆∆CT = 9.13 ± 0.42; 折叠变化 = 558.50; ACP71R_07005: ∆∆CT = 1.89 ± 0.42; 折叠变化 = 3.71; bfnL: ∆∆CT = 6.05 ± 0.42; 折叠变化 = 66.29; basA: ∆∆CT = 4.32 ± 0.42; 折叠变化 = 19.96）（图4D），提示铁获取途径在模拟宿主条件下强烈诱导。
HKAB-1的高抗生素敏感表型与之前观察到的某些鲍曼不动杆菌和沃尔夫不动杆菌分离株一致，这些分离株尽管对抗生素敏感，仍能引发多种感染[56 Darby 2024]。值得注意的是，沃尔夫不动杆菌通常被认为抗生素敏感且携带较少的抗性基因，但近期已成为新生儿重症监护病房感染的常见原因，且日益与多重耐药表型相关[56 Darby 2024, 57 Chatterjee 2016]。这些发现表明，抗生素敏感性并不一定排除医院暴发的可能性，不动杆菌属仍可能在临床选择压力下获取抗性决定因素。与此观察一致，HKAB-1的基因组分析显示存在多种抗生素抗性基因，包括编码临床上重要的RND外排泵的基因，这些是鲍曼不动杆菌中多重耐药表型的关键贡献者[58 Nowak 2015]。有趣的是，HKAB-1中adeB的转录水平较低（∆CT = -10.11 ± 0.15），相比之下，ATCC19606为（∆CT = -2.85 ± 0.15），HKAB-1和ATCC19606之间的比较基因分析显示HKAB-1中adeB下调（ΔΔCT = -7.27 ± 0.21; 折叠变化 = 0.0065）。相比之下，在标准生长培养基中，adeG和adeJ的表达水平无显著差异。这些发现提示，adeB表达的减少可能是HKAB-1增加敏感性的原因，因为该外排泵在临床鲍曼不动杆菌分离株的多重耐药性中至关重要[8 Rumbo 2013, 59 Marchand 2004]。此外，其他抗性机制（如β-内酰胺酶或非RND外排系统）的活性降低或下调也可能导致观察到的抗生素敏感表型。总的来说，这些发现表明，尽管HKAB-1目前保持抗生素敏感，但其具有在适当选择压力下表达和激活抗性特征的遗传潜力，需要在临床环境中对这类菌株进行仔细监测。
HKAB-1在宿主中引发感染的能力使我们假设该菌株可能表现出比实验室菌株ATCC19606更强的毒力表型。与此假设一致，表型表征显示，HKAB-1在血清和干燥条件下显示出优越的生长能力，生物膜形成能力增强，并表现出群集和抽搐运动性，这些都是鲍曼不动杆菌中已确立的毒力相关特性[13 Skiebe 2012, 41 Lee 2008, 42 Espinal 2012, 43 Magda 2022]。之前研究表明，获取多重耐药性通常会带来适应性成本，包括生长受损和对环境压力的耐受性降低，而增强的生物膜形成可能抵消鲍曼不动杆菌的抗生素敏感性[45 Greene 2016, 60 Espinal 2019]。与这些观察一致，HKAB-1尽管对所有测试抗生素高度敏感，但显示出增强的干燥抗性和强大的生物膜形成能力（图1E, 2E）。值得注意的是，HKAB-1还表现出更高的代谢能力，表现为更快的生长动力学和更高的生物量产出（在MH2B和血清培养基中更高的OD600读数）（图1A, 1D）。正交基因组（COG）类别的比较分析显示，HKAB-1在多个与生长相关的功能中拥有更多基因，包括能量生产和转化（C）、氨基酸代谢（E）、无机离子运输（P）、细胞膜生物合成（M）和碳水化合物代谢（G）（图S2）。这些COG的丰富提示了营养摄取、代谢途径基因和膜合成的增强调控，这可能共同减少生理瓶颈并提高生长效率。特别值得注意的是，我们观察到HKAB-1中adeB外排泵基因显著下调。鉴于抗性机制相关的能量成本[61 Andersson 2010]，adeB表达的减少可能缓解代谢负担，从而有助于改善生长。总的来说，这些发现可能支持一种模型，即抗菌抗性的降低被增强的毒力特性和环境适应性所抵消。这种权衡的分子机制尚不清楚，需要进一步研究。
进一步的基因组分析显示，HKAB-1携带hemO基因簇（ACP71R_11060–ACP71R_11105）以及额外的血红素利用簇1（ACP71R_06965–ACP71R_07025）（表S3）。hemO簇常见于多重耐药流行菌株，被认为与增加的毒力相关[55 de Léséleuc 2014, 62 Ou 2015]，并通过促进从血红素获取铁增强细菌在血清中的存活[55 de Léséleuc 2014]。与这些发现一致，我们观察到在血清暴露下，hemO和ACP71R_07005（分别编码血红素氧化酶和假定的TonB依赖性受体）显著上调。此外，在这些条件下，涉及铁载体acinetobactin（basA）和fimsbactin（bfnL）生物合成的基因也显著上调。这些结果表明，血红素利用和铁载体介导的铁获取对血清中的细菌适应性至关重要。我们认为，hemO簇、血红素利用簇1和多种铁载体系统的共同存在有助于HKAB-1在血清中的优越存活，血清中游离铁有限但富含血红素结合铁[63 Parrow 2013]。虽然已显示ATCC19606能利用血红素，但早期研究使用了高于血清中发现的血红素浓度[64 Zimbler 2009]，这可能解释了其在这些条件下的生长减少。
IV型菌毛（T4P）是鲍曼不动杆菌的关键毒力因子，介导宿主细胞粘附、生物膜形成和抽搐运动性[53 Ronish 2019]。PilN和PilO是PilMNOP内膜对齐亚复合体的保守组分，PilNO的适当异二聚化对T4P生物合成至关重要[65 Leighton 2015]。比较基因组分析显示，ATCC19606菌株携带一个受损的pilN基因（表S3）。缺乏功能性pilN可能损害菌毛组装，导致其运动性和生物膜形成的缺陷。相比之下，HKAB-1中所有T4P基因，包括pilN，均完整（表S3），与其保留的抽搐运动性和强大生物膜表型一致。此外，先前研究表明，编码主要菌毛亚单位的pilA的变异可影响菌毛表面静电特性，并调节鲍曼不动杆菌中菌毛相关功能[44 Eijkelkamp 2011, 53 Ronish 2019]。不动杆菌中的PilA变体分为糖基化形式（具有C端丝氨酸残基作为糖基化位点）和非糖基化形式（缺乏该残基）（图S3B）。PilA的糖基化由T4P特异性O-寡糖基转移酶tfpO介导，位于pilA下游[66 Harding 2015]。虽然PilA糖基化的功能影响尚不确定，但菌株特异性变体与不同表型相关[67 Piepenbrink 2016]。例如，AB5075变体与抽搐运动性相关，而ACICU变体促进生物膜形成[53 Ronish 2019]。19株鲍曼不动杆菌菌株的PilA序列系统发育分析显示，HKAB-1的PilA形成一个独特的进化枝，与ACICU、NIPH-329、Ab44444和OIFC137的变体更接近，而与AB5075、BIDMC57或ATCC19606的变体较远（图S3A）。值得注意的是，尽管与ACICU聚类，HKAB-1的PilA缺乏末端丝氨酸残基，属于非糖基化亚组（图S3）。这些发现提示HKAB-1的PilA可能在调节运动性和生物膜形成中具有菌株特异性作用。此外，HKAB-1中pilA和pilO的高表达支持了该菌株观察到的增强的抽搐运动性和生物膜表型（图1E, 2A, 2B, 4C）。
此外，HKAB-1编码bap，一种对鲍曼不动杆菌生物膜发育至关重要的生物膜相关蛋白[50 Loehfelm 2008]，该蛋白也在ATCC19606中存在。HKAB-1中bap和T4P基因（如pilA和pilO）显著升高的表达，结合其在生物膜条件下的进一步诱导以及PNAG生物合成的上调（图4B, 4C），可能是其增强的生物膜形成能力的分子基础。有趣的是，在浮游培养物中表达水平较低的AdeB和AdeG RND外排泵在生物膜条件下高度响应，提示其在生物膜成熟或维持中的作用[68 Richmond 2016]。生物膜形成，部分由Bap和RND外排系统介导，是鲍曼不动杆菌在恶劣宿主和环境条件下持续存在的重要毒力机制[41 Lee 2008, 69 He 2015, 68 Richmond 2016]。先前研究进一步表明，生物膜产生通常与抗生素敏感性和血清抗性相关。具体而言，高生物膜产生的分离株在浮游培养物中通常表现出较低的抗生素抗性，但在面对宿主因子如血清时显示出更高的抗性，以及增强的干燥耐受性[15 Rodríguez-Baño 2008, 42 Espinal 2012, 45 Greene 2016, 70 King 2009]。总的来说，HKAB-1的生物膜形成能力可能在宿主相关应激或抗生素暴露下赋予其选择性优势，并可能促进在生物膜群落中获得或维持多重耐药性。
尽管鲍曼不动杆菌HKAB-1携带多种抗菌抗性基因，包括临床上相关的假定β-内酰胺酶以及多个RND和MFS外排泵，但该菌株对所有测试的抗生素仍保持敏感。值得注意的是，基因组分析还揭示了多种毒力因子和噬菌体序列的存在，表明其基因组结构有利于致病性。具体而言，HKAB-1携带血红素利用簇和多个生物膜相关基因，使其在血清中的存活能力和生物膜形成能力相比ATCC19606显著增强。这些发现强调了对鲍曼不动杆菌临床分离株持续监测的至关重要性，以防止携带广泛多重耐药决定因素的菌株出现和传播。
最低抑菌浓度（MIC，μg/ml）
| 抗生素类别 | 抗生素 | ATCC 19606 | HKAB-1 | |------------|--------|------------|--------| | 氨基糖苷类 | | | | | 阿米卡星 | | 8–16 | 4 | | 庆大霉素 | | 16-32 | 1-2 | | 托布霉素 | | 2-4 | 0.5 | | 碳青霉烯类 | | | | | 多尼培南 | | 0.5 | 0.125 | | 美罗培南 | | 0.5–1 | 0.125–0.25 | | 头孢菌素类 | | | | | 头孢噻肟 | | 16 | 8-16 | | 头孢曲松 | | 64-128 | 32-64 | | 头孢呋辛 | | 128 | 32-64 | | 氟喹诺酮类 | | | | | 环丙沙星 | | 1 | 0.125 | | 左氧氟沙星 | | 0.5 | 0.125-0.25 | | 大环内酯类 | | | | | 阿奇霉素 | | 32-64 | 2–4 | | 克拉霉素 | | 64-128 | 16–32 | | 红霉素 | | 16 | 8 | | 青霉素类 | | | | | 阿莫西林 | | 256 | 16 | | 奥沙西林 | | 256 | 512 | | 哌拉西林 | | 32–64 | 8–16 | | 四环素类 | | | | | 多西环素 | | 1–2 | 0.25 | | 米诺环素 | | 0.5 | 0.125 | | 四环素 | | 16 | 2–4 | | 替加环素 | | 4 | 0.125-0.25 | | 其他抗生素 | | | | | 氯霉素 | | 64–128 | 64–128 | | 克林霉素 | | 256 | 256-512 | | 夫西地酸 | | 256 | 256 | | 利奈唑胺 | | 256–512 | 256–512 | | 呋喃妥因 | | 128-256 | >256 | | 磷霉素 | | >1024 | >1024 | | 多粘菌素B | | 0.25–0.5 | 0.25–0.5 | | 利福平 | | 2 | 4 | | 磺胺甲恶唑 | | 1024 | 1024 | | 甲氧苄啶 | | 64-128 | 32–64 | | 万古霉素 | | 256-512 | 256 |
| 指标 | 值 | |------|------| | 测序读数总数 | 7,674,099 x 2 | | 覆盖率 | 608.3 | | contig数量（≥ 500 bp） | 24 | | 粗略一致性（%） | 99.4 | | 精细一致性（%） | 98.8 | | 完整性（%） | 100 | | 污染（%） | 0.2 | | 基因组大小（bp） | 3,758,367 | | contigs N50（bp） | 365,067 | | contigs L50 | 4 | | 鸟嘌呤-胞嘧啶含量（%） | 38.92 | | 基因总数 | 3,559 | | 编码序列（CDSs）数量 | 3,488 | | tRNA数量 | 63 | | rRNA数量 | 4 |
抗生素抗性
| 位点标签 | 基因 | 蛋白质家族 | 同一性（%） | |----------|------|------------|------------| | 抗生素失活 | | | | | ACP71R_01635 | blaOXA-91 | β-内酰胺酶 | 98.75 | | ACP71R_02890 | blaADC-50 | β-内酰胺酶 | 100.00 | | ACP71R_06460 | blaMBL | β-内酰胺酶 | 99.71 | | ACP71R_07365 | blaOXA-51 | β-内酰胺酶 | 98.79 | | ACP71R_08870 | blaA | β-内酰胺酶 | 97.48 | | ACP71R_14580 | ant(3'')-IIa | 氨基糖苷核苷酰转移酶 | 98.61 | | 外排泵及其调控因子 | | | | | ACP71R_01165 | adeK | 抗性-分裂-细胞分裂 | 99.38 | | ACP71R_01170 | adeJ | 抗性-分裂-细胞分裂 | 99.59 | | ACP71R_01175 | adeI | 抗性-分裂-细胞分裂 | 99.92 | | ACP71R_03190 | adeH | 抗性-分裂-细胞分裂 | 99.17 | | ACP71R_03195 | adeG | 抗性-分裂-细胞分裂 | 97.23 | | ACP71R_03200 | adeF | 抗性-分裂-细胞分裂 | 98.85 | | ACP71R_03205 | adeL | 转录调控因子 | 99.21 | | ACP71R_03230 | abeS | 小分子多重耐药 | 99.70 | | ACP71R_04480 | amvA | 主要易化体超家族 | 97.84 | | ACP71R_04740 | adeN | 转录调控因子 | 98.47 | | ACP71R_05490 | abaQ | 主要易化体超家族 | 98.85 | | ACP71R_05965 | adeT1 | 抗性-分裂-细胞分裂 | 97.49 | | ACP71R_05975 | adeS | 双组分信号转导系统 | 97.33 | | ACP71R_05980 | adeR | 双组分信号转导系统 | 98.66 | | ACP71R_05985 | adeA | 抗性-分裂-细胞分裂 | 98.66 | | ACP71R_05990 | adeB | 抗性-分裂-细胞分裂 | 98.23 | | ACP71R_08510 | abaF | 主要易化体超家族 | 97.75 | | ACP71R_10620 | mexT | 转录调控因子 | 98.89 | | ACP71R_13360 | abeM | 多重抗菌挤出蛋白 | 98.52 | | ACP71R_16955 | craA | 主要易化体超家族 | 100.00 | | ACP71R_17230 | adeT2 | 抗性-分裂-细胞分裂 | 99.58 |
Example for Table 1: Antimicrobial susceptibility of A. baumannii clinical isolate HKAB-1 and ATCC 19606 抗生素敏感性数据 - 鲍曼不动杆菌临床分离株HKAB-1和ATCC 19606
抗生素类别: 氨基糖苷类
抗生素: 阿米卡星
ATCC 19606 MIC (μg/ml): 8–16 HKAB-1 MIC (μg/ml): 4
抗生素: 庆大霉素
ATCC 19606 MIC (μg/ml): 16-32 HKAB-1 MIC (μg/ml): 1-2
抗生素: 托布霉素
ATCC 19606 MIC (μg/ml): 2-4 HKAB-1 MIC (μg/ml): 0.5
抗生素类别: 碳青霉烯类
抗生素: 多尼培南
ATCC 19606 MIC (μg/ml): 0.5 HKAB-1 MIC (μg/ml): 0.125
抗生素: 美罗培南
ATCC 19606 MIC (μg/ml): 0.5–1 HKAB-1 MIC (μg/ml): 0.125–0.25
[... and so on for other categories and antibiotics, abbreviated for brevity]
Example for Table 2: Summary of sequence data and genome features of A. baumannii clinical isolate HKAB-1 基因组特征数据 - 鲍曼不动杆菌临床分离株HKAB-1
指标: 测序读数总数
值: 7,674,099 x 2
指标: 覆盖率
值: 608.3
指标: contig数量（≥ 500 bp）
值: 24
指标: 粗略一致性 (%)
值: 99.4
指标: 精细一致性 (%)
值: 98.8
指标: 完整性 (%)
值: 100
[... and so on for remaining metrics]
Example for Table 3: Predicted antimicrobial resistance of A. baumannii clinical isolate HKAB-1 抗菌抗性预测数据 - 鲍曼不动杆菌临床分离株HKAB-1
类别: 抗生素失活
位点标签: ACP71R_01635
基因: blaOXA-91 蛋白质家族: β-内酰胺酶 同一性 (%): 98.75
位点标签: ACP71R_02890
基因: blaADC-50 蛋白质家族: β-内酰胺酶 同一性 (%): 100.00
[... and so on for other antibiotic inactivation entries]
类别: 外排泵及其调控因子
位点标签: ACP71R_01165
基因: adeK 蛋白质家族: 抗性-分裂-细胞分裂 同一性 (%): 99.38
[... and so on for other efflux pump entries]
(A) 鲍曼不动杆菌菌株的生长曲线使用无滞后期Baranyi和Roberts生长模型拟合。阴影区域表示通过自举法获得的95%置信区间。
(B) 根据拟合生长模型计算的最大特定生长速率（μmax）。
(C) 在5小时时间点测量的600纳米处光密度（OD₆₀₀）。
(D) 鲍曼不动杆菌菌株在MHIIB中和HKAB-1菌株在牛血清白蛋白（血清）中的生长曲线使用改良Gompertz生长模型拟合，而ATCC19606在牛血清白蛋白中的生长曲线使用无ymax的Baranyi和Roberts生长模型拟合。阴影区域表示通过自举法获得的95%置信区间。
(E) 在30℃和37℃下使用结晶紫染色量化的鲍曼不动杆菌菌株形成的生物膜生物量。数据代表个体生物学重复（黑色圆点）和至少三个独立生物学实验的均值±标准误差（SEM）。统计分析使用非配对Student’s t检验进行，必要时使用Welch校正以处理不等方差。
(A-B) 通过在琼脂-塑料界面接种细菌细胞，使用聚苯乙烯培养皿评估抽搐运动性。孵育后用结晶紫染色抽搐区，并测量直径。
(C-D) 通过将细菌培养物点在半固体琼脂表面上评估群集运动性，随后测量群集区直径。
(B, D) 数据代表个体生物学重复（黑色圆点）和至少三个独立生物学实验的均值±标准误差（SEM）。统计分析使用非配对Student’s t检验确定。
(E) 鲍曼不动杆菌ATCC19606和HKAB-1菌株在20–25%相对湿度下的存活率。存活率表示为相对于第0天（设为100%）的菌落形成单位百分比。数据代表五个生物学重复（n = 5），误差条显示标准误差。统计显著性使用Tukey的诚实显著差异检验评估（，p < 0.05；**，p < 0.005）。
(A) 通过Proksee工具生成的HKAB-1草图基因组的圆形染色体图[35 Grant 2023]，包括基因组注释和来自PHASTest的噬菌体[34 Wishart 2023]。
(B) 鲍曼不动杆菌HKAB-1和代表性不动杆菌菌株的核心基因组系统发育树。HKAB-1在鲍曼不动杆菌分支内聚类，与非鲍曼不动杆菌物种如A. pittii、A. junii和A. tandoii明显分离。
x轴上测试基因的ΔCT表示对照样本的计算ΔCT值。点和误差条分别代表n≥3个生物学重复的均值和标准误差（SEM）。显示的SEM是从整个数据集中获得的池估计值。由于所有样本大小相等，误差条长度相同。使用Tukey的HSD检验确定了若干具有高度显著差异的基因（p < 0.005）。
(A) HKAB-1中RND基因的表达水平。以ATCC19606的RND基因表达作为对照。使用ANOVA观察到基因和处理（HKAB-1）之间的显著交互作用[F(3, 12) = 396.70, p < 0.001；见材料与方法]，表明在实验条件下RND基因的差异调控。值得注意的是，HKAB-1中adeB显著下调（ΔΔCT = -7.27 ± 0.21；折叠变化 = 0.0065）。
(B) HKAB-1（处理组）与ATCC19606（对照组）相比的生物膜和运动相关基因的表达水平。使用ANOVA观察到基因和处理之间的显著交互作用[F(7, 28) = 34.04, p < 0.001；见材料与方法]，表明在测试条件下基因调控的差异。值得注意的是，HKAB-1中bap、pilA和pilO显著上调（bap: ΔΔCT = 3.03 ± 0.45；折叠变化 = 8.14；pilA: ΔΔCT = 5.54 ± 0.45；折叠变化 = 46.54；pilO: ΔΔCT = 2.42 ± 0.45；折叠变化 = 5.34）。
(C) HKAB-1生物膜（处理组）与浮游培养物（对照组）相比的生物膜相关基因的表达水平。使用ANOVA观察到基因和处理之间的显著交互作用[F(10, 40) = 125.67, p < 0.001；见材料与方法]，表明在测试条件下基因调控的差异。值得注意的是，生物膜中adeB、adeG、bap、csuC、pilA和pilO显著上调（adeB: ΔΔCT = 7.88 ± 0.43；折叠变化 = 236.19；adeG: ΔΔCT = 7.54 ± 0.43；折叠变化 = 185.98；bap: ΔΔCT = 2.06 ± 0.43；折叠变化 = 4.17；basA: ΔΔCT = 6.05 ± 0.43；折叠变化 = 66.43；bfnL: ΔΔCT = 3.84 ± 0.43；折叠变化 = 14.33；pgaB: ΔΔCT = 5.55 ± 0.43；折叠变化 = 46.79；pilA: ΔΔCT = 2.73 ± 0.43；折叠变化 = 6.62；pilO: ΔΔCT = 3.77 ± 0.43；折叠变化 = 13.60）。
(D) 响应血清（处理组）的血红素获取和铁载体簇基因的表达水平。以MH2B中的基因表达作为对照。使用ANOVA观察到基因和处理之间的显著交互作用[F(4, 36) = 199.85, p < 0.001；见材料与方法]，表明在测试条件下基因调控的差异。所有测试基因在血清暴露下显著上调（basA: ΔΔCT = 4.32 ± 0.42，折叠变化 = 19.96；bfnL: ΔΔCT = 6.05 ± 0.42，折叠变化 = 66.29；hemO: ΔΔCT = 9.13 ± 0.42，折叠变化 = 558.50；ACP71R_07005: ΔΔCT = 1.89 ± 0.42，折叠变化 = 3.71）。
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