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摘要
外排泵是鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）固有和获得性抗生素耐药性的关键介导因子，但其更广泛的生理功能尚未被充分揭示。在本研究中，我们研究了缺失外排泵 AdeAB、AdeIJ 或 CraA 的 A. baumannii ATCC19606 突变株在氯霉素胁迫下的转录组和表型响应。
CraA 缺失突变株的氯霉素最小抑菌浓度（MIC）显著降低了 32 倍，而 adeIJ 缺失导致 MIC 降低 4 倍，adeAB 缺失则对耐药性没有影响。在未处理条件下的转录组分析显示，ΔcraA 株系变化很小，而 ΔadeAB 和 ΔadeIJ 显示出明显的响应，包括核糖体基因、铁-硫簇生物合成、芳香化合物分解代谢以及氨基酸转运系统的上调。
在氯霉素处理下，ΔadeAB 表现出广泛的代谢重编程，激活了氧化应激通路、蛋白质质量控制机制，并下调了第六型分泌系统。相比之下，ΔadeIJ 和野生型菌株则上调了精氨酸和谷氨酸代谢，可能有助于维持 pH 稳定。
所有菌株在氯霉素处理下均诱导了噬菌体相关基因的表达，提示存在一种普遍的胁迫响应。尽管氯霉素处理可诱导 adeAB 和 craA 表达，但仅 craA 缺失显著削弱了耐药性，强调了 CraA 在氯霉素外排中的主导作用。
这些发现揭示了外排泵特异性和菌株特异性的抗生素胁迫适应机制，确立了 CraA 作为 A. baumannii 氯霉素耐药的主要决定因子，并强调了 RND 转运蛋白在胁迫适应和代谢调控中的更广泛生理角色。
重要性
外排泵是已知的鲍曼不动杆菌 (Acinetobacter baumannii) 多药耐药性的主要驱动因素，但其在细菌生理和应激适应中的更广泛作用仍未被充分研究。本研究揭示了在氯霉素胁迫下，CraA、AdeAB 和 AdeIJ 等主要外排系统的缺失如何改变 A. baumannii 的转录组和代谢特征。
我们证实，CraA 是氯霉素耐药的主要介导因子，而 AdeAB 和 AdeIJ 则影响全局性的应激反应，包括氧化应激防御、pH 稳态维持和前噬菌体的激活。这些发现强调了 RND 类转运蛋白在抗生素外排之外的功能，对细胞膜和氧化还原扰动具有适应性作用。
我们的数据提供了关于外排系统层级结构、功能冗余性以及代谢补偿机制的更深入理解。本研究拓展了对 A. baumannii 外排泵介导耐药性及应激生理的认识，有助于为未来干扰细菌持续存在性、提高治疗多药耐药病原体的疗效制定策略。
RND（Resistance-Nodulation-cell Division）类转运蛋白 是一种广泛存在于革兰氏阴性细菌中的膜蛋白，属于外排泵系统的关键部分。它们可以主动将多种有毒物质（包括抗生素）从细胞内部排出，从而帮助细菌获得耐药性。
- 背景
鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种具有高度耐药性的革兰氏阴性兼性好氧球杆菌，尤其在临床环境中表现出多重耐药（MDR）表型。与鲍曼不动杆菌相关的感染主要影响体弱患者，导致呼吸机相关性肺炎、血流感染、尿路感染、脑膜炎和伤口感染，这些疾病通常伴随着较高的发病率和死亡率[1. Peleg 2008]。鲍曼不动杆菌的持久性主要归因于其多重耐药能力及其对多种环境条件的卓越适应性。基因组的可塑性在这种适应性中起着关键作用，使其能够获得多种耐药基因，促使多重耐药鲍曼不动杆菌菌株的广泛出现[1. Peleg, 2. Touchon 2014]。鲍曼不动杆菌耐药性的关键因素包括其限制性的外膜和多样化的多重耐药外排泵家族[3. Vila 2007, 4. Dijkshoorn 2007]。多重耐药甚至泛耐药鲍曼不动杆菌的广泛传播，对现代医学构成了巨大挑战。
氯霉素是一种抑菌性抗生素，通过可逆结合50S核糖体亚基的肽酰转移酶中心，阻断tRNA在核糖体A位点的结合，从而抑制细菌蛋白质合成[5. Schlünzen 2001]。为了对革兰氏阴性菌发挥抗菌作用，氯霉素必须穿过外膜和内膜，进入细胞质；它通过外膜孔蛋白进入，通过被动扩散或YdgR转运蛋白主动转运穿过内膜[6. Burns 1987, 7. Mortimer 1993, 8. Prabhala 2018]。由于潜在的副作用，氯霉素通常用于治疗严重的、危及生命的感染[9. Dinos 等，2016]。然而，临床和农业上的广泛使用导致耐药水平上升。在临床多重耐药菌株中，氯霉素耐药通常通过氯霉素乙酰转移酶介导的酶促失活或通过主动外排机制实现[10. Murray 1997, 11. Schwarz 2004]。然而，在鲍曼不动杆菌中，耐药主要归因于主动外排和膜通透性降低，而非酶促失活[12. Vila 1993]。
最新研究表明，抗生素疗效与细菌代谢状态密切相关，抗生素诱导的代谢失调在决定敏感性中起重要作用[13. Martínez 2011]。因此，细菌耐药不仅受遗传因素控制，还受到代谢活性、应激反应和表型可塑性的影响[14. Kohanski 2008; 15. Lobritz 2015, 16. Brauner 2016]。这些非遗传的短暂耐药机制，通常称为“适应性耐药”，使细菌能够在短暂抗生素暴露下存活，并可能为稳定的长期耐药奠定基础[17. Fernández 2010; 18. Goltermann 2013]。尽管对经典药物-靶点相互作用进行了广泛研究，但鲍曼不动杆菌对抗生素的内在响应仍未被充分理解。鉴于抗菌素耐药性日益加剧及后抗生素时代的潜在威胁，深入了解内在耐受机制对于开发新的抗鲍曼不动杆菌感染策略至关重要。
为探究鲍曼不动杆菌对抗生素的适应性响应，特别是对氯霉素的响应，我们利用RNA测序技术研究了A. baumannii ATCC19606及其Resistance Nodulation cell Division型（RND）外排泵突变株（ΔadeAB和ΔadeIJ）的内在抗生素耐受性。选择氯霉素作为模型抗生素，因为先前研究发现外排泵是ATCC19606耐药的关键决定因素[19. Foong 2019; 20. Foong 2025]。RND家族成员AdeABC和AdeIJK在氯霉素耐药中发挥重要作用[19. Foong 2019]。有趣的是，AdeIJK在鲍曼不动杆菌属中高度保守，体现其核心生理功能，而AdeABC在若干物种中缺失[21. Darby 2023; 22. Naidu 2023]。鉴于它们底物谱重叠但进化历史不同，我们假设删除这些外排泵将在氯霉素应激下引发菌株特异性的代谢适应。研究发现编码主转运蛋白超级家族（MFS）外排泵的craA基因在野生型及RND突变株中低水平表达，但在氯霉素处理后显著上调。此外，ΔadeAB和ΔadeIJ突变株的转录组比较分析揭示了其对氯霉素的调控和代谢响应存在显著差异，为理解鲍曼不动杆菌在缺失特定外排系统时采用的代偿机制提供了新见解。
真核细胞中核糖体数量非常庞大，通常一个典型的真核细胞大约含有1,000万到1亿个核糖体。具体数量会根据细胞类型、活跃程度以及生长状态有所不同。活跃合成蛋白质的细胞（如肝细胞、胰腺细胞、癌细胞）核糖体数量更多，而分裂活跃或生长阶段的细胞核糖体数量也会增加。核糖体主要分布在胞质中，有游离核糖体和附着在粗面内质网上的核糖体，此外真核细胞的线粒体和植物细胞的叶绿体内也含有各自的核糖体。
细菌（原核生物）核糖体为70S，由50S大亚基和30S小亚基组成。50S大亚基含有23S和5S rRNA，30S小亚基含有16S rRNA。16S rRNA在细菌中起到mRNA识别和系统发育分析的重要作用。
真核细胞的核糖体为80S，由60S大亚基和40S小亚基组成。60S大亚基含有28S、5.8S和5S rRNA，40S小亚基含有18S rRNA。Svedberg单位表示分子沉降速率，50S+30S不等于70S，60S+40S也不等于80S。
12S rRNA主要存在于真核细胞的线粒体核糖体小亚基中，而16S rRNA主要存在于细菌核糖体和线粒体大亚基中，两者分别代表不同的rRNA种类和起源。
线粒体核糖体存在于线粒体基质中，负责合成线粒体自身编码的蛋白质，整体沉降系数约为55S至60S，包含39S大亚基和28S小亚基。线粒体核糖体的rRNA含量较低，蛋白质含量较高，体现出其更依赖蛋白质结构支撑的特点。
真核细胞质核糖体沉降系数为80S，由60S大亚基（含28S、5.8S、5S rRNA）和40S小亚基（含18S rRNA）组成，主要负责合成细胞内核基因编码的绝大多数蛋白质。
线粒体核糖体的结构和功能更接近原核核糖体，这也解释了为什么某些抗生素如氯霉素和四环素会影响线粒体蛋白质合成而导致副作用，但不会影响细胞质核糖体。
“底物谱重叠”中的“底物”是指生物体内某种酶或转运蛋白能识别、结合并处理的分子或化合物。简单来说，就是这些蛋白能够作用的靶分子范围。
举个例子： 假设两个外排泵A和B都能识别并排出氯霉素（chloramphenicol）和四环素（tetracycline）这两种抗生素，那么这两种抗生素就是它们的共同底物，也就是说它们的底物谱（能处理的分子范围）存在重叠。
但如果泵A还能排出红霉素（erythromycin），而泵B不能，这就是它们底物谱的不同之处。
总结： - 底物 = 蛋白能结合和处理的分子（如药物、代谢产物等） - 底物谱重叠 = 不同蛋白可以识别和处理一部分相同的分子
这样可以理解不同外排泵在功能上的部分冗余，也有助于细菌在不同压力下灵活应对。
“RND突变株中”中的“RND突变株”指的是经过基因突变，缺失或改变了Resistance-Nodulation-Division (RND) 型外排泵相关基因的细菌株。
具体来说：
举例： 在文章里提到的ΔadeAB和ΔadeIJ菌株，就是缺失了RND家族中adeAB或adeIJ外排泵基因的突变株，研究它们对氯霉素耐药性的影响。
总结： “RND突变株中”即“在缺失或改变了RND外排泵基因的菌株中”的意思。
- 结果
3.1 外排泵基因缺失株对氯霉素的敏感性
为了确定适用于后续基因表达分析的氯霉素浓度，我们测定了野生型 A. baumannii ATCC19606 及其外排泵缺失株（ΔadeAB、ΔadeIJ 和 ΔcraA）的氯霉素最小抑菌浓度（MIC）。
在 LB 培养基中培养时，各菌株的生长曲线分析未显示明显生长缺陷（补充图 S1A）。MIC 分析显示菌株对氯霉素的敏感性存在显著差异：与野生型相比，ΔadeIJ 和 ΔcraA 分别表现出 4 倍 和 32 倍 的 MIC 降低（见表 1）。
与这些发现一致的是，在含氯霉素的 LB 培养基中进行的生长实验表明，ΔcraA 显示出显著敏感性（MIC = 2 μg/ml，IC₅₀ = 2.77 μM），ΔadeIJ 表现出中等敏感性（MIC = 16 μg/ml，IC₅₀ = 23.59 μM）（图 1A，表 1，补充图 S1、S2）。
相比之下，adeAB 的缺失并未改变对氯霉素的敏感性（ΔadeAB 和野生型 MIC 均为 64 μg/ml）（见表 1），两者在添加 16 μg/ml 氯霉素时的最大生长速率（μmax）也相似（野生型：0.31 h⁻¹；ΔadeAB：0.29 h⁻¹）（表 1，图 1B）。
不过，在其他生长参数中观察到细微但可重复的差异，例如 IC₅₀（野生型：46.23 μM；ΔadeAB：40.33 μM）、滞后期（野生型：5.95 h；ΔadeAB：7.24 h）以及达到最大生长速率的时间（野生型：7.4 h；ΔadeAB：9.2 h）（图 1B，表 1，补充图 S2）。
这些结果表明，尽管 adeAB 缺失并不影响 MIC，但在氯霉素压力下引起了轻微的生长延迟，提示其参与一定程度的抗生素诱导应激反应。(CHECK 结论 is correct？) ✅ 优化建议版本：这些结果表明，尽管 adeAB 缺失并不改变氯霉素的最低抑菌浓度（MIC），但在氯霉素处理下，ΔadeAB 菌株表现出轻微但可重复的生长延迟，提示其可能在一定程度上参与了抗生素诱导的应激反应。
LB 是 Luria-Bertani 培养基 的缩写，是一种在微生物学中广泛使用的营养丰富的液体或固体培养基，主要用于培养细菌（尤其是大肠杆菌）等微生物。
LB培养基既可以做成液体（用于摇瓶培养），也可以做成固体（加入琼脂，用于平板培养）。
3.2 外排泵基因的表达分析 (Figure 1)
为评估外排泵基因缺失对基因调控的影响，我们检测了所有突变株中 adeB、adeG、adeJ、craA 和 ompA 的表达水平。令人意外的是，无论是 adeAB、adeIJ 还是 craA 缺失，其它外排泵基因或 ompA 的表达水平均未发生显著变化，与野生型相比的 ∆∆CT 值接近于零（见图 1C）。值得注意的是，ompA 的较高 ∆CT 值显示其具有较高的基础表达水平，并不受氯霉素处理影响（图 1C）。
鉴于 craA 是否在 RND 类外排泵突变株中持续表达尚不明确 [20. Foong 2025, 37. Coyne 2011]，我们定量检测了野生型、ΔadeAB 和 ΔadeIJ 菌株中 craA 的转录水平。在未经处理的条件下，craA 表达水平较低（野生型 ∆CT = –4.77 ± 0.26；ΔadeIJ ∆CT = –4.98 ± 0.30；ΔadeAB ∆CT = –3.98 ± 0.34）（图 1D）。与既往研究一致 [20. Foong 2025]，在氯霉素处理后，除 ΔcraA 突变株外，所有菌株中 craA 的表达均显著上调（野生型 ∆∆CT = 3.80 ± 0.60, p < 0.001；ΔadeIJ ∆∆CT = 3.43 ± 0.45, p < 0.001；ΔadeAB ∆∆CT = 3.98 ± 0.44, p < 0.001）（图 1D）。这表明 craA 并非持续表达，而是在氯霉素胁迫下被诱导表达。
相反，RND 类外排泵（adeB、adeG 和 adeJ）的表达在氯霉素处理后没有明显变化。虽然 adeG 的表达低于 adeB 和 adeJ，但其作用似乎有限。此外，氯霉素处理后，ΔadeIJ 菌株中 ompA 表达略有下降（∆∆CT = –1.08 ± 0.47, p = 0.339），但该差异无统计学意义。
综上数据表明，在 A. baumannii ATCC19606 中，CraA 是氯霉素耐药的主要外排泵，而 AdeIJK 在一定程度上提供辅助性抗药性。
3.3 外排泵突变株的全局转录组响应 (Figure 2)
为研究 A. baumannii ATCC19606 中主要外排系统在基础条件下的生理功能，我们对野生型及其同源敲除突变株（ΔadeAB、ΔadeIJ 和 ΔcraA）在 LB 培养基中生长后的样本进行了 RNA 测序。主成分分析（PCA）显示，生物学重复之间聚类紧密，同时野生型与各突变株之间呈现明显分离（图 2A），说明数据质量较高，且基因表达模式具有明确的基因型依赖性。
在所有突变株中，ΔadeAB 表现出最显著的全局转录变化：与 ΔcraA、ΔadeIJ 和野生型相比，分别有 413、336 和 168 个差异表达基因（DEGs）（|log₂FC| > 1.2，padj < 0.05）（图 2B，数据集 1）。相比之下，ΔadeIJ 和 ΔcraA 的差异表达基因数量显著较少，分别为 51 个和 5 个（图 2B，数据集 1）。
这些结果表明，AdeAB 的功能远不止于药物外排，还在维持细胞稳态方面发挥更广泛的作用。
3.4 外排泵失活引发不同的通路级适应反应 (Figures 3 and 4, NEED to be optimized!)
KEGG 和 GO 富集分析显示，RND 外排泵，尤其是 AdeAB 和 AdeIJ 的失活，在 A. baumannii ATCC19606 中引发了显著且不同的生理响应（图 3，补充表 S2、S3）。与 ΔadeIJ 比较，ΔadeAB 突变株显著富集了 18 条 KEGG 通路，而野生型仅富集了 4 条，ΔcraA 相关的比较中则无显著富集（图 3A，补充表 S2）。值得注意的是，13 条 KEGG 通路（包括氨基酸代谢、脂肪酸代谢和中心碳代谢相关通路）在 ΔadeAB 与 ΔadeIJ，以及 ΔadeAB 与 ΔcraA 中均受到扰动，表明存在部分重叠的调控效应（图 3A，补充表 S2）。此外，ΔadeAB 在较宽松的阈值（调整后 p 值 < 0.1）下，丙酸盐代谢通路显著下调（图 4A，补充表 S4），提示该通路可能参与对外排泵缺失的补偿响应。
ΔadeIJ 突变株表现出 35 个显著富集的 GO 术语，主要涉及对化学刺激的响应、解毒和有机酸代谢（图 3C，补充表 S3）。上调的关键基因包括编码 ABC 转运蛋白、重金属外排系统（如 copB、铜 ATP 酶）及苯乙酸降解酶（图 4B，补充表 S3），这表明 AdeIJK 缺失导致代谢负担和金属离子积累。相比之下，ΔadeAB 的 GO 分析仅发现两个富集术语，均与跨膜转运活性相关（图 3B，补充表 S3）。上调基因包括多药外排转运蛋白 craA、hisQ、mgtA 和一个推测的 NAD(P)+ 转氢酶操纵子（H0N29_15930–15940）（图 4B、4C，补充表 S3），后者在氯霉素应激下显著被抑制（图 4C、4D，数据集 1）。
有趣的是，当采用较宽松的显著性阈值（调整后 p 值 < 0.1）时，ΔadeAB 中独特富集了额外的差异表达基因类别，包括与 RNA 加工和铁硫（Fe–S）簇生物合成相关的通路（补充表 S4、S5，数据集 1）。其中，Fe–S 簇装配关键组分 iscU 和 iscA 均被上调，同时多种 RNA 结合及加工基因也被激活（表 S5，数据集 1）。这些转录变化表明，AdeAB 缺失触发了与氧化还原失衡和 RNA 代谢紊乱相关的细胞应激反应。此外，与 ΔadeIJ 和 ΔcraA 不同，ΔadeAB 突变株还表现出转录调控因子的显著下调（图 4E），暗示 adeAB 失活通过调控抑制引起了全局代谢重编程。
综上所述，这些发现强调了 RND 外排泵在维持细胞稳态中的非冗余功能，其中 AdeIJK 介导广谱解毒和膜重塑，而 AdeAB 则影响转录调控、中心代谢及 Fe–S 簇维护。
3.5 氯霉素诱导野生型及 RND 外排泵缺失株的不同代谢和转录变化 (Figure 3)
为表征与外排泵无关的氯霉素适应机制，我们将野生型及突变株暴露于氯霉素亚抑制浓度下，进行比较转录组分析。主成分分析（PCA）验证了样本的重复性，并显示各基因型处理组与未处理组间明显分离（图 2A）。氯霉素处理引起显著的转录变化，响应程度因菌株而异：ΔadeAB 有 232 个差异表达基因（DEGs），野生型有 117 个，ΔadeIJ 有 68 个（图 2C，数据集 1）。综合来看，adeAB 操纵子的失活在 A. baumannii 中引发更广泛且独特的转录变化，区别于 ΔadeIJ 及亲本菌株。
为解析 A. baumannii ATCC19606 在氯霉素暴露下的代谢适应，我们对野生型、ΔadeAB 和 ΔadeIJ 的 DEGs 进行了 KEGG 通路和基因本体（GO）富集分析（图 3，补充表 S2、S3）。共有六条 KEGG 通路在所有菌株中对氯霉素显著富集（图 3A，补充表 S2）。其中，丙酮酸代谢（map00620，调整后 p 值 < 0.05）持续被富集，涉及的转录本 H0N29_06915 和 H0N29_06930 均显著上调（log2FC > 3.5）（数据集 1）。这些基因推测参与乙醇代谢（图 5），表明该响应独立于 RND 型外排机制。
除丙酮酸代谢外，精氨酸/脯氨酸代谢及精氨酸生物合成通路在野生型与 ΔadeIJ 中保持一致（图 3A），涉及上调的 astB、H0N29_06915 和 H0N29_10275 转录本（图 3A，图 4F，补充表 S2）。值得注意的是，精氨酸琥珀酰转移酶（ast）操纵子（包括 astA、astB、astD、astE 和 H0N29_01755）在野生型中显著上调（log2FC > 1.6，调整后 p 值 < 0.05；图 4F，数据集 1）。在 ΔadeIJ 突变株中，仅 astB 显著上调，其他基因虽表达趋势相似，但无统计学显著性（图 4F，补充表 S5，数据集 1）。氯霉素压力下精氨酸生物合成通路的富集令人关注，因为此通路主要与杀菌性抗生素的致死作用相关，而非抑菌性响应[38. Yang 2019]。相反，丙酸代谢通路相关转录本（如 H0N29_06915 和 H0N29_16235）在 ΔadeAB 和野生型中均被富集（图 3A，图 4A，补充表 S2）。有趣的是，酪氨酸代谢及丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢通路仅在 ΔadeIJ 中富集（图 3A，补充表 S2）。
GO 分析显示，野生型的 DEGs 富集于转运、氨基酸代谢和有机酸代谢相关类别（图 3B-C，补充表 S3）。而 ΔadeAB 的 DEGs 则富集于应激相关过程，如环境响应、蛋白折叠及胞外区定位（图 3B-C，补充表 S3），包括蛋白酶和伴侣蛋白基因（如 H0N29_03910、groL、grpE、dnaK、clpB、htpG、H0N29_01635 及 lon），还有 uvrB 和若干假定蛋白（补充表 S3）。值得注意的是，冷休克蛋白 H0N29_06030 和 H0N29_12010 在 ΔadeAB 中下调（数据集 1），但未被 GO 注释到任何类别。ΔadeAB 在抑菌条件下蛋白质稳态相关基因的强烈上调尤为显著，这类反应通常与杀菌性压力相关，可能代表一种补偿性适应机制[14. Kohanski 2008，18. Goltermann 2013]。相比之下，ΔadeIJ 的 DEGs 主要富集于氨基酸和有机酸代谢通路（图 3B-C，补充表 S3）。
3.6 氯霉素应激下的转运蛋白及外排泵调控 (Figure 4)
在氯霉素处理的菌株中，多药外排泵编码转录本 adeA、adeB 和 craA（H0N29_01695）均为高丰度，唯独在 ΔadeAB 中因 adeAB 被删除而缺失（图 4G，数据集 1）。craA 的高表达符合其作为 ATCC19606 主要氯霉素耐药因子的已知作用（图 1，图 2B，表 1，图 4B，补充表 S3）[19. Foong 2019]。有趣的是，craA 在 ΔadeAB 背景下即使未暴露于氯霉素也上调（图 4B，数据集 1），暗示存在潜在的补偿性调控。此外，adeAB 对氯霉素的过表达似乎与 craA 的表达相关联（图 4G，数据集 1），支持两者协同的外排机制[19. Foong 2019]。
推测的重金属抗性外排系统（CusA/CzcA 家族；H0N29_01325–H0N29_01340）转录本在 ΔadeIJ 和野生型中均上调（图 4G，数据集 1）。相比之下，编码三元外排系统组分的 adeT1 和 H0N29_15145 在 ΔadeAB 中差异表达，但在任何菌株中均未被氯霉素诱导（图 4B、4G，数据集 1），提示其功能可能与抗生素外排无关，或许参与信号传导或解毒过程。MFS 转运蛋白 abaQ 在 ΔadeAB 氯霉素处理中显著上调（图 4G，数据集 1），其表达升高伴随 H0N29_08175 和 H0N29_08180 的上调（数据集 1），符合其多顺反子基因组织结构[39. Pérez-Varela 2017]。
除经典外排系统外，多种转运蛋白差异表达。在野生型中，“跨膜转运活性”（GO:0022857）富集，涉及氨基酸或离子转运相关基因（图 2B，补充表 S3）。氯霉素处理还诱导了钾转运复合体 KdpABC 和氨基酸通道蛋白 H0N29_01015，同时抑制了 ΔadeIJ 中的水通道蛋白 aqpZ（图 4D、4G，补充表 S3）。这些发现与先前关于 kdpA 介导单价阳离子相关抗生素耐受性的报告一致[40. Hood 2010]。此外，氨基酸 ABC 转运子操纵子 H0N29_10590–H0N29_10610（不含 H0N29_10590）在 ΔadeAB 中显著下调（图 4G）。
3.7 氯霉素对外膜蛋白的影响有限 (Figure 4)
A. baumannii 外膜固有的低通透性是其本身耐药性的已知因素之一 [3. Vila 2007；4. Dijkshoorn 2007]。大多数外膜蛋白（OMPs），包括 ompA、ompW、carO、abuO 和 omp33–36，在氯霉素处理或外排泵失活条件下的表达均无显著变化（数据集 1）。值得注意的是，几种 TonB 依赖性受体在 RND 外排泵缺失菌株中出现差异调控，例如 H0N29_07770 和 H0N29_00810 在 ΔadeIJ 中特异性调控，而 H0N29_12215 和 H0N29_10730 在 ΔadeAB 中下调（图 4C）。此外，H0N29_05340（编码一个推定的 OmpW 家族蛋白）和 H0N29_17775（编码一个推定的 TonB 依赖性铜离子受体）分别在氯霉素应激下的野生型和 ΔadeIJ 中呈差异表达（图 4D）。
3.8 转录调控因子及额外的应激响应基因 (Figure 4)
鉴于转录调控在抗生素响应中的重要性 [41. Deter 2021]，我们分析了氯霉素应激下的转录因子表达情况。出人意料的是，氯霉素并未广泛诱导转录调控因子的表达（图 4H）。TetR/AcrR 类型调控因子 H0N29_05015（与 ATCC17978 中的 A1S_2396 同源）在 ΔcraA 和 ΔadeIJ 中显著下调（图 4E，数据集 1）。另一个调控因子 H0N29_08595 在 ΔadeIJ 和野生型菌株中也被氯霉素下调（图 4H）。虽然 ΔadeAB 中有多个调控因子下调，但氯霉素对这些基因在该突变株中的表达影响甚微（图 4E、4H）。
有趣的是，氯霉素仅在 ΔadeAB 中抑制了 第六型分泌系统（T6SS） 的表达（补充表 S5），提示 AdeAB 系统与 T6SS 之间可能存在调控交叉。相反，在未加抗生素时，ΔadeAB 中 T6SS 基因呈上调状态（补充表 S5）。
所有菌株在氯霉素诱导下均显示出 与噬菌体相关基因（H0N29_05405–H0N29_05795 区段） 的上调（补充表 S5）。与金属稳态和毒力相关的 锰和尿素代谢（mum）操纵子 在野生型中强烈上调（图 4F），但其 LysR 型调控因子 H0N29_11480 未被诱导。有趣的是，该操纵子在其他应激条件下（如乙醇和过氧化氢）通常下调 [43. Camarena 2010；44. Juttukonda 2018]，说明其表达可能受到氯霉素特异性调控。
然而，删除 mumT 并未影响菌株对氯霉素的敏感性，提示其上调可能更多是为适应应激环境，而非直接赋予内在抗性（补充图 3）。
- Materials and methods
2.1 Bacterial strains and growth conditions
All the A. baumannii strains (Supplementary Table 1) were maintained at -80°C in 20% glycerol. A. baumannii strains were cultured in sterile LB media. E. coli S17-1 λpir donor strains harbouring the plasmid pMo130-TelR_cloned-fragments were cultured in sterile LB media supplemented with 50 mg/L kanamycin.
2.2 Construction of astA and transporter genes knockout
Construction of A. baumannii ATCC19606 adeAB, adeIJ, astA, and craA was performed as described [19. Foong 2019; 23. Amin 2013], and all primers used are listed in Supplementary Table S1. PCR products of upstream and downstream of the gene encoding RND or CraA efflux pumps were cloned into pBIISK_sacB/kanR by Gibson assembly. The resulting plasmids were electroporated into A. baumannii cells using The MicroPulser System (program Ec1) and subsequently, transformants were selected on LB agar + 50 mg/L kanamycin. In contrast, the upstream and downstream sequences of the astA gene were cloned into pMo130-TelR by Gibson assembly. Conjugation was performed by incubating the mixture of E. coli S17-1 donor strain harbouring the plasmid pMo130- TelR_astA and A. baumannii strain on LB agar and incubated at 30°C for 24 h. The conjugants were resuspended in sterile LB liquid medium and plated onto LB agar + 30 mg/L tellurite + 50 mg/L ampicillin. Counter-selection was performed on LB + 15% sucrose and gene knockout mutants were verified by sequencing.
2.3 Drug agar plate assay
Drug susceptibility assays were performed as previously described [19. Foong 2019]. Briefly, cell cultures of A. baumannii ATCC19606 strains were diluted to OD600 100-10‐5 and 3 μL of the diluted cultures were spotted on LB agar plate supplemented with chloramphenicol. Plates were incubated at 37°C overnight.
2.4 MIC measurement
Minimum inhibitory concentration (MIC) of chloramphenicol was conducted using the microdilution method [24. Foong 2020]. Approximately 25 μl of overnight cultures of A. baumannii ATCC19606 wildtype and the efflux pump knockout strains (OD 600 of 0.5) were inoculated into 4 mL of serial 2-fold chloramphenicol dilutions in LB medium, followed by 18 hours of incubation at 37°C at 130 rpm. The readout of OD 600 at 16 h was used to calculate the 50% inhibitory concentration of growth (IC50).
2.5 Growth curve analysis
Growth curve analysis was performed as previously described [25. Tam 2020]. Briefly, overnight cell cultures of A. baumannii strains were diluted into fresh LB medium at an OD600 of 0.02. For each of the strains, 30 μl diluted cultures were inoculated into 120 μl of LB liquid medium supplemented with chloramphenicol (final concentration = 8 and 16 μg ml-1) in liquid medium in a polystyrene, U-bottom 96-well plate. OD 600 of the cell cultures was measured every 20 min for 16 h at 37°C with agitation using Tecan Microplate Reader (Tecan, Switzerland). IC50 was estimated by fitting the data to a four parameter logistic model using “dr4pl” package in R 4.4.1 [26. R Core Team; 27. An 2019].
Each of the bacterial growth efflux curves were individually analyzed by wrangle and analyze growth curve data method (“gcplyr” package) in R 4.4.1 [ 26. R Core Team; 28. Blazanin 2024]. Each of the bacterial growth parameters such as maximum growth rates (μmax), lag time, the minimum time required to reach μmax, and the minimum time required to reach growth rate of 0.2 h-1 (T0.2/h ) were analyzed between wildtype and RND knockout strains, by a linear mixed effects model by maximum likelihood with a random intercept for each experiments with an Equation “Parameter ~ 0 + Genotype + (1 | Exp)”, using “lmerTest” package in R 4.4.1 [26. R Core Team; 29. Kuznetsova 2017]. Pairwise comparisons of growth parameters of wildtype and ΔadeB were analyzed by general linear hypotheses and Tukey’s multiple comparison test using “multcomp” package in R 4.4.1 [26. R Core Team; 30. Hothorn 2008].
2.6 RNA extraction
Overnight cultures of A. baumannii ATCC19606 wildtype, ∆adeAB, ∆adeIJ, and ∆craA were inoculated into 50 mL of LB medium supplemented with subinhibitory concentration (Table 1) of chloramphenicol to an initial OD600 of 0.05. Cultures were incubated at 37°C with 130 rpm to an OD 600 of 0.5–0.7. For the untreated samples (control), cells were grown in LB medium without chloramphenicol to the same growth phase. Cell suspensions of 500 μL were collected and treated with the RNAprotect bacteria reagent (Qiagen). RNA extraction was conducted using RNeasy Mini Kit (Qiagen). DNA was removed by on- column DNA digestion (Qiagen) and Turbo DNase (Invitrogen). RNA samples were purified by RNeasy MinElute Cleanup kit (Qiagen). The concentration and the quality of the RNA samples were determined by Agilent 2100 Bioanalyzer.
2.7 Reverse transcription qPCR
One-step RT-qPCR was performed on a thermal cycler Rotor-Gene Q (Qiagen) using QuantiNova SYBR Green RT-PCR kit (Qiagen) using the primers listed in Supplementary Table S1, with rpoB as reference gene. Gene expression was analyzed as previously described [24. Foong 2020]. The ΔCT values were calculated as CT(rpoB) – CT(efflux pump). Mean differences in ΔCT values between ‘Antibiotic treatment’ groups and ‘Control’ groups or between ‘Gene knockout’ groups and ‘Control’ group, were analyzed by an ANOVA model in R version 4.4.1 with Gene and Gene:Treatment interaction [26. R Core Team 2021].
2.8 Library construction, RNA sequencing and quality control (TODO: to check and improve!)
Bacterial ribosomal RNA was removed from the total RNA using the Ribo-Zero kit and then precipitated with ethanol. After random mRNA fragmentation, the first strand cDNA was synthesized using random hexamer primers. RNase H, DNA polymerase I, dNTPs, and dUTPs were added in the second-strand synthesis buffer (Illumina) to initiate the second- strand synthesis. The construction of double-stranded cDNA libraries was completed after a series of terminal repair, A-tailing, sequencing adapter ligation, size selection, and PCR enrichment. The quality of libraries was checked with Qubit 2.0 and real-time PCR for quantification and Agilent 2100 Bioanalyzer for size distribution detection. RNA sequencing was performed using Novogene in-house protocol on the Illumina NovaSeq platform (HWI- ST1276) with paired-end 150 bp sequencing strategy (Novogene Co. Ltd., Beijing, China).
In total, 18 RNA-seq samples were processed using the nf-core framework for RNA-seq analysis (nf-core/rnaseq v1.3dev) to obtain raw counts [31. Ewels 2020], with CP059040 (Acinetobacter baumannii strain ATCC 19606) as the reference genome. The nf-core pipeline offers multiple alignment options, with HISAT2 (v2.1.0) selected for this analysis [32. Kim 2019]. FeatureCounts was then employed to assign reads to genomic features and quantify gene expression levels [33. Liao 2014]. The raw RNA-seq counts were normalized and variance-stabilized using the regularized log transformation (rlog) from DESeq2 [34. Love 2014], which reduces the variance-over-mean trend. DESeq2 was subsequently used to identify differentially expressed genes (DEGs) between conditions, with genes considered significantly enriched if they exhibited a fold change > 1.2 and an adjusted p-values < 0.05. Normalized rlog counts were used for downstream clustering analysis and visualization. Principal component analysis (PCA) and sample distance heatmaps confirmed high reproducibility across all biological replicates. Gene enrichment analysis was performed using the clusterProfiler package in R [35. Wu 2021], incorporating Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway analyses to identify molecular functions, biological processes, cellular components, and metabolic pathways significantly associated with the DEGs. UpSet plots were generated in R 4.4.1 [26. R Core Team] using “ComplexUpset” package [36. Krassowski, 2020].
讨论 (Figures 1-5)
外排泵被广泛认为是 A. baumannii 固有与获得性抗生素耐药的关键介导因素，与低膜通透性和抗生素修饰酶一道发挥作用 [3. Vila 2007；4. Dijkshoorn 2007]。我们的数据表明，在标准培养条件下敲除 RND 外排系统并不会引起显著的转录组变化（图 2B，数据集 1），这与在 AB5075 菌株中观察到的结果一致 [45. Leus 2020]。尤为如此的是 craA 缺失株，在没有该外排系统时，转录组数据显示生理负担较小（图 2B，数据集 1）。
值得注意的是，RND 外排泵缺失株（ΔadeAB 和 ΔadeIJ）与 AB5075 菌株的对应突变株表现出不同反应。例如在 AB5075 中，ΔadeIJK 突变株会上调与生物膜形成、外排泵、脂肪酸代谢、铁获取和碳代谢相关的基因，表明 AdeIJK 具有广泛的调控作用 [45. Leus 2020]。而在 ATCC19606 中，ΔadeIJ 更倾向上调苯乙酸分解、ABC 转运蛋白、氨基酸及无机离子稳态相关基因（图 3A、3C、4B，补充表 S2-S3），反映出菌株特异性的适应反应。
在 AB5075 中敲除 adeB 会显著影响噬菌体簇、外排转运蛋白、转录调控因子及碳代谢相关基因的表达 [45. Leus 2020]。相比之下，ATCC19606 的 ΔadeAB 表现出独特的转录特征：核糖体蛋白、转运蛋白及 Fe–S 簇生物合成相关基因上调，同时丙酸代谢下调（图 3B、4A–4C，补充表 S2–S5）。ISC 系统相关基因（如 iscU、NfuA、GrxD）也被富集，暗示可能启动氧化应激防御路径（补充表 S5）。尽管 A. baumannii 中 Fe–S 簇在应激反应中的作用尚未完全阐明，这些机制可能增强细胞对氧化还原失衡或抗生素损伤的耐受性 [46–48]。我们的研究暗示，AdeAB 更可能通过清除内源性有毒代谢产物、缓解氧化应激发挥生理作用，而非直接参与氯霉素外排。
尽管在氯霉素处理下，野生型和 ΔadeIJ 菌株均表现出 adeA 和 adeB 表达水平升高，但 adeAB 的失活并未改变 MIC 值（表 1）。相比之下，craA 缺失将 MIC 降低 32 倍（表 1），突显其在氯霉素外排中的核心地位 [19、20]。此外，我们还观察到 ΔadeAB 背景下在氯霉素胁迫下 craA 表达增强（图 4G，数据集 1），可能作为对 AdeAB 缺失的补偿机制。这些结果表明，在耐药响应中 CraA 担任主要角色，而 AdeIJK 或 AdeAB 在压力条件下提供辅助支持（图 5）。有趣的是，尽管 ΔadeIJ 突变株 MIC 降低 4 倍，但 adeIJK 在氯霉素处理下表达变化不大，表明 RND 系统在应激条件下可能由不同调控机制控制。
外膜通透性作为耐药的另一个决定因素，其基因表达在氯霉素处理下未发生显著改变（图 4D，数据集 1）。尽管已有文献指出 OmpA 与氯霉素耐药相关 [49. Smani 2014]，但我们的结果显示所有菌株在氯霉素处理下外膜蛋白表达基本稳定（图 4D、4E，数据集 1），与此前认为 OMP 表达调控主要发生在转录后水平的报告一致 [40. Hood 2010；50. Yun 2008]。
在外排机制之外，我们观察到所有菌株均表现出前噬菌体基因富集（补充表 S5），支持前噬菌体可能在 A. baumannii 的抗生素胁迫耐受与环境适应中发挥作用的观点 [51、52]。此外，在 ΔadeIJ 与野生型中也观察到精氨酸/脯氨酸代谢、丙酮酸代谢和脲酶活性相关的代谢适应（图 3A、4I、5A–5B，补充表 S2），这些通路共同汇聚于谷氨酸生成，伴随氨与 CO₂ 产生（图 5A–5B）。尽管 astA（ast 操纵子的首个基因）缺失未显著影响氯霉素敏感性（补充图 3），但 AST 通路的激活、可能的精氨酸外排蛋白 ArgO 上调和谷氨酸脱氢酶 gdhA 下调（图 4D、5A、补充表 S2）显示细菌通过调节 pH 稳态及缓解应激来实现代谢适应，而非直接提高抗性。这些发现与此前关于胞内谷氨酸和精氨酸储备有助于抵抗氧化与膜损伤的研究一致 [53、54]。
ΔadeAB 突变株表现出最显著的应激适应策略，包括上调脂肪酸降解、NAD(P)+ 转氢酶基因、SOS 应答因子及蛋白质质量控制机制（如蛋白酶和伴侣蛋白）（图 3A、4D、5C，补充表 S2–S5）。尤其在氯霉素处理下该菌株冷休克蛋白下调（图 5C，数据集 1），可能反映应激响应路径之间的权衡，因为这些蛋白已知与氯霉素敏感性调节相关 [55. Tomlinson 2022]。此外，在 ΔadeAB 中，醌类耐药转运蛋白基因 abaQ 高表达，而 wildtype 中 abaQ 缺失并不影响氯霉素敏感性（图 4G、5C，补充图 3），提示其在氯霉素应激下可能承担更广谱底物识别或补偿性外排功能。ΔadeAB 突变株中，氯霉素抑制 T6SS 表达的现象也值得关注（图 5C，补充表 S5），因为 T6SS 的失活曾与增强抗生素耐受性有关 [56. Weber 2015]。这些结果表明 ΔadeAB 突变株持续面临膜损伤和氧化应激，需要复杂的代谢和调控补偿机制。
结论
A. baumannii 已演化出高度灵活的代谢与营养策略，使其能在恶劣环境中持续存活 [40. Hood 2010；42. Juttukonda 2016；56. Weber 2015]。本研究为 A. baumannii 针对氯霉素胁迫提供了菌株特异性适应机制的全面视角，突出了 CraA 作为主导外排因子的核心作用，同时揭示 RND 外排系统失活所引发的意想不到的转录组响应（图 5）。外排调控、中心代谢与应激生理之间的相互作用，凸显了耐药性复杂性的重要性，并强调在研究 A. baumannii 耐药性时需考虑菌株层面的差异。
“RND突变株中”中的“RND突变株”指的是经过基因突变，缺失或改变了Resistance-Nodulation-Division (RND) 型外排泵相关基因的细菌株。
具体来说：
举例： 在文章里提到的ΔadeAB和ΔadeIJ菌株，就是缺失了RND家族中adeAB或adeIJ外排泵基因的突变株，研究它们对氯霉素耐药性的影响。
总结： “RND突变株中”即“在缺失或改变了RND外排泵基因的菌株中”的意思。
| 名称 | 类型 | 功能 | |------|------|------| | CraA | MFS外排泵 | 氯霉素耐药 | | AdeIJK | RND外排泵 | 多药排出，核心代谢功能 | | AdeAB | RND外排泵 | 多药排出（可变存在） | | RND | 外排泵家族 | 多药抗性关键机制 | | MumT | 转运蛋白 | 氧化/硫代代谢平衡 | | KdpABC | 钾离子泵 | 电位和渗透压维持 | | ArgO | 精氨酸外排 | pH调节和碱性适应 | | T6SS | 分泌系统 | 毒性、菌群竞争 |
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